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Sonda de inversión molecular

La sonda de inversión molecular ( MIP ) [ 1 ] pertenece a la clase de técnicas moleculares de captura por circularización [ 1 ] para realizar la partición genómica , un proceso ...

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La sonda de inversión molecular ( MIP ) [ 1 ] pertenece a la clase de técnicas moleculares de captura por circularización [ 1 ] para realizar la partición genómica , un proceso mediante el cual se capturan y enriquecen regiones específicas del genoma. [ 2 ] Las sondas utilizadas en esta técnica son moléculas de ADN monocatenario y, al igual que otras técnicas de partición genómica, contienen secuencias complementarias al objetivo en el genoma ; estas sondas se hibridan con el objetivo genómico y lo capturan. La MIP se distingue de otras estrategias de partición genómica en que las sondas MIP comparten el diseño común de dos segmentos complementarios del objetivo genómico separados por una región de enlace. Con este diseño, cuando la sonda se hibrida con el objetivo, experimenta una inversión en su configuración (como sugiere el nombre de la técnica) y se circulariza. Específicamente, las dos regiones complementarias del objetivo en los extremos 5' y 3' de la sonda se vuelven adyacentes entre sí, mientras que la región de enlace interna forma un bucle libre. Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en el proyecto HapMap para el genotipado de SNP a gran escala [ 3 ] , así como para el estudio de alteraciones en la copia de genes [ 4 ] y características de loci genómicos específicos [ 2 ] [ 5 ], con el fin de identificar biomarcadores para diferentes enfermedades, como el cáncer. Entre las principales ventajas de la tecnología MIP se incluyen su alta especificidad para el objetivo y su escalabilidad para análisis multiplexados de alto rendimiento, donde se analizan simultáneamente decenas de miles de loci genómicos .

Procedimiento técnico

Características de una sonda de inversión molecular típica
Procedimiento para la captura de regiones genómicas mediante sondas de inversión molecular.

Estructura de la sonda de inversión molecular

Las sondas están diseñadas con secuencias que son complementarias al objetivo genómico en sus extremos 5' y 3' . [ 2 ] [ 3 ] [ 6 ] La región interna contiene dos sitios de cebadores de PCR universales que son comunes a todos los MIP, así como un sitio de liberación de sonda , que generalmente es un sitio de restricción . [ 3 ] Si la identificación del objetivo genómico capturado se realiza utilizando enfoques de hibridación basados ​​en matrices , la región interna puede contener opcionalmente una secuencia de etiqueta específica de la sonda que identifica de manera única la sonda dada, así como un sitio de liberación de etiqueta , que, de manera similar al sitio de liberación de sonda, también es un sitio de restricción .

Protocolo

  • Sonda de hibridación al ADN diana genómico

Se añaden sondas a la muestra de ADN genómico. Tras una desnaturalización seguida de un paso de hibridación, los extremos complementarios de la sonda se hibridan con el ADN diana. En este proceso, las sondas se circularizan. Sin embargo, estas sondas están diseñadas de tal manera que queda un hueco delimitado por los extremos hibridados sobre la región diana. El tamaño de este hueco varía desde un solo nucleótido para la genotipificación de SNP [ 3 ] hasta varios cientos de nucleótidos para la captura de loci (por ejemplo, captura de exoma ) [ 5 ] .

  • Relleno de huecos

La polimerasa de ADN rellena el hueco utilizando nucleótidos libres y la ligasa une los extremos de la sonda , dando como resultado una sonda completamente circularizada.

  • Retire las sondas que no hayan reaccionado.

Dado que no se realiza el relleno de huecos para las sondas que no han reaccionado, estas permanecen lineales. El tratamiento con exonucleasa elimina estas sondas que no han reaccionado, así como cualquier resto de ADN lineal en la reacción.

  • Comunicado de la sonda

En algunas versiones del protocolo, el sitio de liberación de la sonda (generalmente un sitio de restricción ) se escinde mediante enzimas de restricción, lo que da lugar a la linealización de la sonda. En esta sonda linealizada, las secuencias de los cebadores universales de PCR se ubican en los extremos 5' y 3', y el objetivo genómico capturado pasa a formar parte del segmento interno de la sonda. Otros protocolos mantienen la sonda como una molécula circularizada.

  • Enriquecimiento de objetivos capturados

Si la sonda está linealizada, se realiza una amplificación por PCR tradicional para enriquecer la secuencia diana capturada utilizando los cebadores universales de la sonda. En caso contrario, se realiza una amplificación por círculo rodante para la sonda circular.

  • Identificación del objetivo capturado

El objetivo capturado puede identificarse mediante enfoques de hibridación basados ​​en matrices [ 3 ] o mediante la secuenciación del objetivo [ 5 ] . Si se utiliza un enfoque basado en matrices, la sonda puede contener opcionalmente una etiqueta específica que la identifica de forma única, así como la región genómica a la que se dirige. Las etiquetas de cada sonda se liberan mediante la escisión del sitio de liberación de la etiqueta con enzimas de restricción. Estas etiquetas se hibridan con las secuencias colocadas en la matriz y que son complementarias a ellas. El objetivo capturado también puede identificarse mediante la secuenciación de la sonda, que ahora también contiene el objetivo. Para ello, se puede utilizar la secuenciación Sanger tradicional o tecnologías más económicas y de alto rendimiento como SOLiD , Illumina o Roche 454 .

Análisis multiplex Aunque cada sonda examina un locus genómico específico, se pueden combinar varias sondas en un solo tubo para realizar un ensayo multiplexado que examine simultáneamente múltiples loci. Actualmente, el análisis MIP multiplexado puede examinar más de 55 000 loci en un solo ensayo. [ 2 ]

Historia del desarrollo de la técnica

Esquemas de sondas de candado, sondas de inversión molecular y sondas de inversión de conector.

Sonda de candado

El diseño de las sondas de inversión molecular (MIP) se originó a partir de las sondas de candado, una técnica de biología molecular descrita por primera vez por Nilsson et al. en 1994. [ 7 ] Al igual que las MIP, las sondas de candado son moléculas de ADN monocatenario con dos segmentos de 20 nucleótidos complementarios a la secuencia diana, conectados por una secuencia de enlace de 40 nucleótidos. Cuando las regiones complementarias a la secuencia diana se hibridan con el ADN diana, las sondas de candado también se circularizan. Sin embargo, a diferencia de las MIP, las sondas de candado están diseñadas de tal manera que las regiones complementarias a la secuencia diana abarcan toda la región diana tras la hibridación, sin dejar huecos. Por lo tanto, las sondas de candado solo son útiles para detectar moléculas de ADN con secuencias conocidas.

Nilsson et al. [ 7 ] demostraron el uso de sondas de candado para detectar numerosos objetivos de ADN , incluyendo un oligonucleótido sintético y un clon genómico circular. Las sondas de candado tienen alta especificidad hacia su objetivo y pueden distinguir moléculas objetivo que se parecen mucho entre sí. Nilsson et al. [ 7 ] también demostraron el uso de sondas de candado para diferenciar entre un receptor de conductancia de fibrosis quística ( CFCR ) normal y uno mutante, donde el CFCR mutante tenía una deleción de 3 pb correspondiente a uno de los extremos de la sonda. Dado que la ligación requiere que los extremos de la sonda estén inmediatamente adyacentes entre sí cuando se hibridan con el objetivo, la deleción de 3 pb en el mutante impidió una ligación exitosa. Las sondas de candado también se utilizaron con éxito para hibridación in situ para detectar repeticiones alfaides específicas del cromosoma 12 en una muestra de cromosomas en estado metastásico . Aquí, las sondas de oligonucleótidos lineales tradicionales no dieron resultados. [ 7 ] Por lo tanto, las sondas de candado poseen suficiente especificidad para detectar elementos de copia única en el genoma . [ 7 ]

Sonda de inversión molecular

Para realizar la genotipificación de SNP , Hardenbol et al. [ 3 ] modificaron las sondas de candado de manera que, cuando la sonda se hibrida con el objetivo genómico, se produce un hueco en la posición del SNP. El relleno del hueco mediante un nucleótido complementario al nucleótido en la ubicación del SNP determina la identidad del polimorfismo. Este diseño ofrece numerosas ventajas sobre la técnica de sonda de candado más tradicional. El uso de múltiples sondas de candado específicas para un SNP plausible requiere un equilibrio cuidadoso de la concentración de estas sondas específicas de alelo para garantizar que los recuentos de SNP en un locus dado estén correctamente normalizados. [ 3 ] Además, con este diseño, las sondas defectuosas afectan a todos los genotipos en un locus dado por igual. [ 3 ] Por ejemplo, dado que las sondas MIP pueden analizar múltiples genotiposEn un locus genómico particular, si la sonda para un locus dado no funciona (por ejemplo, no se hibrida correctamente con el objetivo genómico), no se detectará ninguno de los genotipos en ese locus. En cambio, para las sondas de candado, se necesita diseñar una sonda de candado distinta para detectar cada genotipo plausible en un locus dado (por ejemplo, se necesita una sonda de candado para detectar "A" en un locus SNP dado y otra sonda de candado para detectar "T" en el mismo locus). Por lo tanto, una sonda de candado defectuosa solo afectará la detección del genotipo específico para el que fue diseñada, mientras que una sonda MIP defectuosa afectará todos los genotipos en el locus. Usando MIP, se evita la posible llamada incorrecta de SNP, ya que si la sonda diseñada para analizar un locus dado no funciona, no se generan datos para ese locus y no se realiza la llamada de SNP.

En su procedimiento, Hardenbol et al. [ 3 ] analizaron simultáneamente más de 1000 loci SNP en un solo tubo que contenía más de 1000 sondas con diseños distintos. El conjunto de sondas se dividió en cuatro tubos para cuatro reacciones diferentes. En cada reacción, se utilizó un nucleótido distinto (A, T, C o G) para rellenar los huecos. Solo cuando el nucleótido en el locus SNP era complementario al nucleótido aplicado , el hueco se cerraba por ligación y la sonda se circularizaba. La identificación de los SNP capturados se realizó en matrices de genotipado donde cada punto de la matriz contenía secuencias complementarias a las etiquetas específicas del locus en las sondas. Dado que el coste de la matriz de ADN es un factor importante en el coste de esta técnica, se comparó el rendimiento de la detección de cuatro chips y un color con la detección de dos chips y dos colores. Los resultados fueron similares en términos de tasa de llamada de SNP y relación señal/ruido . [ 3 ]

En un informe reciente, [ 6 ] este grupo logró aumentar el nivel de multiplexación para analizar simultáneamente más de 10 000 loci SNP, utilizando 12 000 sondas distintas. El estudio examinó polimorfismos SNP en 30 muestras de tríos (cada trío constaba de una madre, un padre y su hijo). Conociendo los genotipos de los padres, la precisión de los genotipos SNP predichos en el niño se determinó examinando si existía concordancia entre los patrones de herencia mendeliana esperados y los genotipos predichos. Se encontró que la tasa de concordancia de tríos era > 99,6 %. [ 1 ] Además, se desarrolló un conjunto de métricas de rendimiento específicas para MIP. Este trabajo estableció el marco para el genotipado SNP de alto rendimiento en el proyecto HapMap . [ 6 ]

Sonda de inversión de conector

Para capturar regiones genómicas más largas que un solo nucleótido, Akhras et al. [ 5 ] modificaron el diseño de MIP extendiendo el espacio delimitado por los extremos de la sonda hibridada y denominaron al diseño Sonda de Inversión Conectora (CIP). El espacio corresponde a la región genómica de interés que se desea capturar (por ejemplo, exones ). La reacción de relleno del espacio se realiza con ADN polimerasa , utilizando los cuatro nucleótidos . La identificación de las regiones capturadas se puede realizar mediante su secuenciación utilizando cebadores específicos del locus que se mapean a uno de los extremos complementarios objetivo de las sondas.

Akhras et al. [ 5 ] también desarrollaron el sistema de códigos de barras de candados multiplexados (MMP) para reducir los costos de los reactivos. Un solo ensayo puede involucrar muestras de ADN de múltiples individuos y examinar múltiples loci genómicos en cada uno. Un sistema de códigos de barras de ADN que identifica de forma única cada combinación plausible de individuo y locus genómico se representa mediante etiquetas de ADN insertadas en la región de enlace de las sondas. De esta manera, las secuencias de las regiones capturadas incluirían el código de barras, lo que permite la determinación inequívoca del individuo y del locus genómico al que pertenece la región capturada.

Este grupo también ha desarrollado un software para diseñar CIP específicos de locus ( CIP creator 1.0.1 ).

Solicitud

La técnica de sonda de inversión molecular (MIP) es una de las más utilizadas para capturar una pequeña región del genoma para su posterior análisis. Con la invención de las tecnologías de secuenciación de nueva generación, el coste de secuenciar genomas completos ha disminuido drásticamente; sin embargo, sigue siendo demasiado elevado para que estas máquinas de secuenciación se utilicen en todos los laboratorios. Por ello, se pueden emplear diferentes técnicas de partición del genoma para aislar regiones más pequeñas, pero altamente específicas, para su posterior análisis. La MIP, por ejemplo, se puede utilizar para capturar dianas para el genotipado de SNP , la variación del número de copias o los estudios de desequilibrio alélico, entre otros.

Genotipado de SNP

En la genotipificación de SNP , las sondas se separan en cuatro reacciones y se añade un tipo diferente de nucleótido a cada una. Si el SNP en la región objetivo es complementario al nucleótido añadido, la ligación es exitosa y la sonda se circulariza completamente. Dado que cada sonda se hibrida con un único SNP objetivo en el genoma, las sondas circularizadas con éxito proporcionan las identidades de nucleótidos de los SNP . Las secuencias de etiquetas de las cuatro reacciones específicas de nucleótidos se hibridan a cuatro matrices de genotipificación o a dos matrices de doble color (un canal para cada reacción). El análisis de qué puntos de la matriz están unidos a las etiquetas permite determinar las identidades de los SNP en los loci genómicos representados por dichas etiquetas.

Los SNP a los que apunta MIP pueden utilizarse posteriormente en áreas de investigación como el análisis de loci de rasgos cuantitativos (QTL) o los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS), donde los SNP se utilizan en estudios de desequilibrio de ligamiento indirecto o se analizan directamente para detectar mutaciones causantes .

Detección de variación del número de copias

La técnica de sonda de inversión molecular también puede utilizarse para la detección de variaciones en el número de copias (CNV). Esta doble función en la genotipificación de SNP y el análisis de CNV de MIP es similar a la de los microarrays de genotipificación de SNP de alta densidad , que recientemente se han utilizado también para la detección y el análisis de CNV. Estas técnicas extraen las intensidades de señal específicas de alelo de los datos de genotipificación y las utilizan para generar resultados de CNV. Estas técnicas ofrecen mayor precisión y resolución que las técnicas tradicionales, como los análisis cariotípicos con bandas G , la hibridación fluorescente in situ (FISH) o la hibridación genómica comparativa en microarrays (aCGH).

Investigación actual

La técnica MIP se ha utilizado ampliamente en muchas áreas de investigación; a continuación se describen algunos ejemplos del uso de esta técnica en la literatura reciente:

Diseño y optimización de MIP

Estrategias de optimización del diseño de sondas

Para optimizar el grado de multiplexación y las longitudes de las regiones capturadas, se deben considerar varios factores al diseñar las sondas: [ 2 ]

  • Las secuencias de la sonda que son complementarias al ADN diana deben ser específicas y mapearse únicamente en regiones únicas con una complejidad de secuencia razonable en el genoma. Las regiones genómicas que contienen repeticiones deben tratarse con precaución.
  • Para todas las sondas utilizadas en un solo ensayo, las temperaturas de hibridación de los dos extremos complementarios objetivo de las sondas deben ser similares de manera que la hibridación de los dos extremos con sus objetivos se pueda lograr a la misma temperatura. [ 3 ]
  • El contenido de GC de los objetivos genómicos debe ser similar y la variabilidad de las longitudes de los objetivos debe estar restringida de manera que todos los huecos puedan rellenarse en plazos de elongación similares. [ 2 ]
  • Un alto contenido de AC en la secuencia de la sonda parece aumentar la eficiencia de amplificación, y las secuencias palindrómicas parecen disminuir la eficiencia de amplificación [ 13 ] - potencialmente a través de la formación de estructuras secundarias.
  • La longitud de la sonda parece afectar la eficiencia de amplificación [ 14 ] con una variación periódica con un máximo cada 10,5 pares de bases. [ 15 ]
  • Las longitudes de los objetivos genómicos no pueden ser demasiado largas (las aplicaciones exitosas actuales funcionaron con longitudes de objetivo de 100 a 200 pb [ 2 ] ), de lo contrario, los efectos estéricos pueden interferir con la hibridación exitosa de las sondas a sus objetivos. [ 2 ]
  • Las etiquetas de cada sonda utilizada para la identificación de regiones capturadas mediante microarrays deben tener temperaturas de fusión similares y complejidades de base ortogonales máximas. Esto garantiza que todas las etiquetas puedan hibridarse con el microarray en condiciones similares y que se minimicen las hibridaciones cruzadas.

Estrategias de optimización del protocolo MIP

Se pueden modificar varias condiciones experimentales para la optimización, [ 2 ] estas incluyen:

Estos factores son críticos ya que en un estudio, las estrategias de optimización adecuadas aumentaron la eficiencia de captura del objetivo del 18 al 91 por ciento. [ 16 ]

Métricas de rendimiento

Turner et al. 2009 [ 2 ] resumieron dos métricas que se informan comúnmente en experimentos de captura genómica basados ​​en MIP que identifican el objetivo mediante secuenciación.

  • Uniformidad de captura : análoga a la exhaustividad : la fracción de objetivos genómicos que se capturan con confianza. Específicamente, la abundancia relativa de lecturas de secuencia que se asignan a cada objetivo genómico.
  • Especificidad de captura : análoga a la precisión : la fracción de lecturas de secuencia que realmente se corresponden con los objetivos genómicos de interés.

Estas dos métricas se ven directamente afectadas por la calidad del lote de sondas. Para mejorar los resultados con sondas de baja calidad, se pueden realizar secuenciaciones con mayor profundidad. La cantidad de secuenciación necesaria aumenta de forma casi exponencial a medida que disminuyen la uniformidad y la especificidad .

Hardenbol et al. 2005 [ 6 ] propusieron un conjunto de métricas relacionadas con la genotipificación de SNP utilizando MIP.

  • Relación entre genotipos únicos y ruido : Relación entre el número de genotipos verdaderos y el número de genotipos de fondo.
  • Tasa de conversión de sondas : Número de loci SNP genómicos para los que se pueden diseñar sondas y analizarlas con éxito. En otras palabras, esta métrica se refiere a la fracción de sondas que producen resultados de genotipado.
  • Tasa de detección : Para un locus SNP determinado , es el número de muestras de ADN cuyos genotipos en dicho locus pueden medirse. En otras palabras, es el número de evidencias que respaldan el o los genotipos asignados al locus SNP en cuestión.
  • Integridad : Para el conjunto de SNP analizados, la fracción total de genotipos que se obtienen con éxito.
  • Precisión : Para el conjunto de SNP analizados, la fracción de genotipos detectados que son correctos. Esto se suele medir mediante la repetibilidad de los resultados.

Existe una compensación inherente entre la tasa de conversión de sondas y la precisión . Eliminar las sondas que arrojaron genotipos incorrectos aumenta la precisión, pero disminuye la tasa de conversión de sondas. Por el contrario, usar un umbral de aceptación de sondas menos estricto aumenta la tasa de conversión de sondas, pero disminuye la precisión . [ 6 ]

Otras técnicas de partición genómica

Descripción general de las diferentes técnicas de partición genómica

Para reducir los costes de secuenciación de genomas completos, se han propuesto muchos métodos que enriquecen regiones genómicas específicas de interés.

Otros métodos de captura por circularización

Método de selección de genes : [ 18 ] Se realiza un paso inicial de PCR múltiple para enriquecer los objetivos de interés. Los productos de PCR se circularizan al hibridar con sondas específicas para el objetivo con secuencias complementarias a los dos cebadores utilizados en el paso de PCR.

Captura mediante el método de circularización selectiva : [ 19 ] El ADN genómico se digiere en fragmentos con enzimas de restricción . Utilizando sondas selectoras con regiones flanqueantes complementarias al objetivo de interés, los fragmentos de ADN digeridos se circularizan al hibridar con las sondas selectoras.

Comparación del rendimiento entre técnicas de partición genómica

Cada método demuestra las ventajas y desventajas que implica en cuanto a uniformidad, especificidad de captura, coste, escalabilidad y disponibilidad.

  • En términos de especificidad de captura , los métodos de captura por circularización demuestran los mejores resultados. Esto se debe a que todos los métodos de esta clase requieren que los dos extremos de la misma molécula de ADN (por ejemplo, los dos extremos de las sondas MIP) se unan simultáneamente a una única molécula asociada (por ejemplo, la región diana genómica) en la configuración adecuada para una ligación exitosa .
  • En cambio, los métodos de captura por circularización muestran menor uniformidad en comparación con otros métodos. Esto se debe a que el diseño de la sonda para cada objetivo genómico es único, por lo que el rendimiento entre las distintas sondas puede variar.
  • En cuanto a la escalabilidad , la alta especificidad de los métodos de captura por circularización y captura en solución los convierte en los más adecuados para estudios que involucran un gran número de objetivos genómicos y muchas muestras. Las técnicas de captura basadas en microarrays son apropiadas para estudiar muchos objetivos genómicos, pero con menos muestras debido a la resolución y especificidad limitadas de los microarrays . Los métodos de PCR múltiple son los más adecuados para estudios a pequeña escala debido a su facilidad de uso y disponibilidad de reactivos.
  • Los costos asociados a cada técnica son difíciles de comparar debido a la gran variedad de diseños y condiciones experimentales. Sin embargo, para cada técnica, alcanzar un alto nivel de multiplexación , donde se analizan muchos loci simultáneamente, amortiza los costos.

Ventajas de MIP

  • A diferencia de otras técnicas de genotipado , se elimina la necesidad de amplificar la muestra de ADN mediante PCR antes de la aplicación de MIP. Esto resulta beneficioso al examinar simultáneamente un gran número de secuencias objetivo, donde es probable que se produzca interferencia entre pares de cebadores [ 3 ].
  • Alta especificidad : La alta especificidad se logra mediante: i) A diferencia de otras técnicas de genotipado altamente multiplexadas , MIP utiliza pasos enzimáticos (polimerización y ligación de ADN) en solución para capturar loci específicos, seguidos de un paso de amplificación . Esta combinación de pasos enzimáticos confiere un alto grado de especificidad al ensayo MIP [ 22 ] ii) El tratamiento con exonucleasa elimina las sondas lineales no reaccionadas iii) Las secuencias de etiquetas se seleccionan de manera que aumenten la especificidad en la hibridación y, por lo tanto, eviten la interferencia en el paso de detección [ 3 ] iv) Las secuencias complementarias objetivo en ambos extremos de la sonda están físicamente limitadas para interactuar localmente [ 3 ]
  • Control de calidad integrado de la relación señal/ruido : la técnica MIP examina la posibilidad de las cuatro bases para cada posición de SNP. Se espera que un SNP homocigoto tenga una sola señal y un SNP heterocigoto tenga dos señales. Por lo tanto, la relación señal/ruido se puede monitorear utilizando los alelos de fondo y, si una llamada tiene una señal sospechosa, se puede descartar del análisis posterior [ 3 ].
  • Se pueden alcanzar altos niveles de multiplexación (del orden de 10 4 -10 5 sondas en un ensayo) [ 2 ].
  • Se necesita una cantidad baja de ADN de muestra (por ejemplo, 0,2  ng/ SNP [ 3 ] ) ya que las sondas MIP se pueden aplicar directamente al ADN genómico en lugar de a bibliotecas de secuenciación aleatoria.
  • Alta concordancia : se encontró que la tasa de concordancia de tríos es > 99,6% [ 1 ]
  • Reproducibilidad : la genotipificación del mismo individuo varias veces demostró que los SNP genotipados eran concordantes (99,9%) [ 3 ].
  • Alto rango dinámico : en estudios de detección de CNV , se pueden detectar hasta 60 copias de regiones amplificadas en el genoma [ 22 ].
  • Dado que MIP requiere solo 40 pares de bases de ADN genómico intacto, su uso en muestras degradadas , como muestras incluidas en parafina fijadas con formaldehído , puede ofrecer ventajas distintivas [ 22 ].
  • Su infraestructura sencilla (solo se requieren reactivos y herramientas comunes de sobremesa) y su diseño simple hacen que esta técnica sea ampliamente aplicable en muchos laboratorios.
  • Las opciones de plataforma para identificar el objetivo capturado son muy flexibles, lo que permite mejorar la rentabilidad. Por ejemplo, los objetivos capturados pueden secuenciarse directamente, evitando la necesidad de construir una biblioteca de secuenciación .

Limitaciones de MIP

  • La sensibilidad y la uniformidad son relativamente bajas en comparación con otras técnicas de captura genómica, ya que no todos los objetivos pueden capturarse bajo las mismas condiciones experimentales para análisis de alto rendimiento que involucran múltiples sondas. Sin embargo, un estudio reciente que utilizó sondas con regiones de enlace más largas mejoró la uniformidad. [ 23 ]
  • Los tamaños plausibles del objetivo que se puede capturar son limitados ya que i) Una región de brecha grande conduce a restricciones estéricas [ 2 ] para la circularización intramolecular de la sonda y ii) Una brecha grande requiere que se sinteticen sondas más largas, lo que aumenta los costos.
  • El grado de multiplexación está limitado por la capacidad de multiplexación del método elegido para la identificación del objetivo. Si se utilizan métodos de detección basados ​​en matrices , el número de objetivos que se pueden analizar está limitado por los puntos disponibles en la matriz.
  • Dado que se necesita una sonda distinta para capturar cada región, analizar muchas regiones resulta costoso . Sin embargo, con la multiplexación, los costos se amortizan. Por ejemplo, con un nivel de multiplexación de 1000, los costos se reducen a $0.01 por sonda para cada análisis. [ 3 ]
  • Las condiciones de reacción de MIP pueden requerir optimización , lo cual es particularmente importante para analizar sitios heterocigotos . [ 16 ]

Véase también

Referencias

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  • Software para la creación de sondas de inversión de conectores (CIP)