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Articulo de referencia

Citogenética molecular

Imagen: ejemplo de cariotipado que muestra un total de 46 cromosomas en el genoma. La citogenética molecular combina dos disciplinas, la biología molecular y la citogenética , e...

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Imagen: ejemplo de cariotipado que muestra un total de 46 cromosomas en el genoma.

La citogenética molecular combina dos disciplinas, la biología molecular y la citogenética , e implica el análisis de la estructura cromosómica para ayudar a distinguir las células normales de las cancerosas. La citogenética humana se inició en 1956 con el descubrimiento de que las células humanas normales contienen 46 cromosomas. Sin embargo, las primeras observaciones microscópicas de cromosomas fueron publicadas por Arnold, Flemming y Hansemann a finales del siglo XIX. Su trabajo fue ignorado durante décadas hasta que se descubrió que el número real de cromosomas en humanos era de 46. En 1879, Arnold examinó células de sarcoma y carcinoma con núcleos muy grandes. Hoy en día, el estudio de la citogenética molecular puede ser útil para diagnosticar y tratar diversas neoplasias malignas, como neoplasias hematológicas, tumores cerebrales y otros precursores del cáncer. El campo se centra en el estudio de la evolución de los cromosomas, más específicamente en el número, la estructura, la función y el origen de las anomalías cromosómicas. [ 1 ] [ 2 ] Incluye una serie de técnicas denominadas hibridación in situ con fluorescencia , o FISH, en las que las sondas de ADN se marcan con etiquetas fluorescentes de diferentes colores para visualizar una o más regiones específicas del genoma. Introducida en la década de 1980, FISH utiliza sondas con secuencias de bases complementarias para localizar la presencia o ausencia de regiones específicas de ADN. FISH puede realizarse como un enfoque directo a cromosomas en metafase o núcleos en interfase. Alternativamente, se puede adoptar un enfoque indirecto en el que se puede evaluar todo el genoma para cambios en el número de copias utilizando cariotipo virtual. Los cariotipos virtuales se generan a partir de matrices compuestas por miles o millones de sondas, y se utilizan herramientas computacionales para recrear el genoma in silico .

Técnicas comunes

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Imágenes FISH de cromosomas de células en división de orangután (izquierda) y humano (derecha). La sonda amarilla muestra 4 copias de una región en el genoma del orangután y solo 2 copias en el humano.

La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) mapea secuencias de ADN de copia única o repetitivas mediante el marcaje de localización de ácidos nucleicos específicos. La técnica utiliza diferentes sondas de ADN marcadas con etiquetas fluorescentes que se unen a una o más regiones específicas del genoma. [ 3 ] Marca todos los cromosomas individuales en cada etapa de la división celular para mostrar anomalías estructurales y numéricas que pueden surgir a lo largo del ciclo. Esto se hace con una sonda que puede ser específica de locus, centromérica, telomérica y de cromosoma completo. Esta técnica se realiza típicamente en células en interfase y tejidos en bloques de parafina. La FISH mapea secuencias de ADN de copia única o repetitivas mediante el marcaje de localización de ácidos nucleicos específicos. La técnica utiliza diferentes sondas de ADN marcadas con etiquetas fluorescentes que se unen a una o más regiones específicas del genoma. Las señales de las etiquetas fluorescentes se pueden ver con microscopía , y las mutaciones se pueden ver comparando estas señales con células sanas. Para que esto funcione, el ADN debe desnaturalizarse usando calor o químicos para romper los enlaces de hidrógeno; esto permite que ocurra la hibridación una vez que se mezclan dos muestras. Las sondas fluorescentes crean nuevos enlaces de hidrógeno, reparando así el ADN con sus bases complementarias, lo cual puede detectarse mediante microscopía. La técnica FISH permite visualizar diferentes partes del cromosoma en distintas etapas del ciclo celular . La FISH puede realizarse mediante un enfoque directo en cromosomas en metafase o núcleos en interfase. Alternativamente, se puede adoptar un enfoque indirecto en el que se puede evaluar todo el genoma para detectar cambios en el número de copias mediante cariotipado virtual. Los cariotipos virtuales se generan a partir de microarrays compuestos por miles o millones de sondas, y se utilizan herramientas computacionales para recrear el genoma in silico . [ 4 ]

Hibridación genómica comparativa (CGH)

La hibridación genómica comparativa (CGH), derivada de FISH, se utiliza para comparar variaciones en el número de copias entre una muestra biológica y una referencia. La CGH se desarrolló originalmente para observar aberraciones cromosómicas en células tumorales. Este método utiliza dos genomas, una muestra y un control, que se marcan con fluorescencia para distinguirlos. [ 5 ] En la CGH, se aísla el ADN de una muestra tumoral y se le añade biotina . Otra proteína de marcaje, la digoxigenina, se une a la muestra de ADN de referencia. [ 6 ] Las muestras de ADN marcadas se co-hibridan con sondas durante la división celular, que es el momento más informativo para observar la variación en el número de copias . [ 7 ] La CGH crea un mapa que muestra la abundancia relativa de ADN y el número de cromosomas. Al comparar la fluorescencia en una muestra con la de una referencia, la CGH puede señalar ganancias o pérdidas de regiones cromosómicas. [ 6 ] [ 8 ] La CGH difiere de FISH porque no requiere un objetivo específico ni conocimiento previo de la región genética que se analiza. La CGH también permite analizar un genoma completo con relativa rapidez para detectar diversos desequilibrios cromosómicos, lo cual resulta útil en pacientes con problemas genéticos subyacentes y cuando no se dispone de un diagnóstico oficial. Esto suele ocurrir con los cánceres hematológicos.

Hibridación genómica comparativa en microarrays (aCGH)

La hibridación genómica comparativa en microarrays (aCGH) permite realizar CGH sin cultivo ni aislamiento celular. En su lugar, se realiza en portaobjetos de vidrio que contienen pequeños fragmentos de ADN. [ 9 ] Eliminar el paso de cultivo y aislamiento celular simplifica y acelera drásticamente el proceso. Utilizando principios similares a los de la CGH, el ADN de la muestra se aísla y se marca con fluorescencia, luego se co-hibrida con sondas monocatenarias para generar señales. Se pueden detectar miles de estas señales a la vez, y este proceso se denomina cribado paralelo. [ 10 ] Se miden las razones de fluorescencia entre las señales de la muestra y de referencia, que representan la diferencia promedio entre la cantidad de cada una. Esto mostrará si hay más o menos ADN de la muestra de lo esperado por la referencia.

Aplicaciones

Una célula que contiene una reordenación de las regiones cromosómicas bcr/abl (cromosomas rojo y verde en la parte superior izquierda). Esta reordenación está asociada con la leucemia mieloide crónica y se detectó mediante FISH.

La hibridación in situ cromosómica FISH permite estudiar la citogenética en muestras pre y postnatales y también se utiliza ampliamente en pruebas citogenéticas para el cáncer. Mientras que la citogenética es el estudio de los cromosomas y su estructura, las pruebas citogenéticas implican el análisis de células en la sangre, el tejido, la médula ósea o el líquido para identificar cambios en los cromosomas de un individuo. Esto se realizaba a menudo mediante cariotipado y ahora se realiza con FISH. Este método se utiliza comúnmente para detectar deleciones o translocaciones cromosómicas frecuentemente asociadas con el cáncer. FISH también se utiliza para lesiones melanocíticas, distinguiendo las lesiones melanocíticas atípicas del melanoma. [ 5 ]

Las células cancerosas suelen acumular cambios estructurales cromosómicos complejos, como pérdida, duplicación, inversión o desplazamiento de un segmento. [ 11 ] Mediante FISH, cualquier cambio en un cromosoma se hace visible a través de discrepancias entre los cromosomas cancerosos marcados con fluorescencia y los cromosomas sanos. [ 11 ] Los resultados de estos experimentos citogenéticos pueden esclarecer las causas genéticas del cáncer y permitir la identificación de posibles dianas terapéuticas. [ 12 ]

La citogenética molecular también puede utilizarse como herramienta diagnóstica para síndromes congénitos cuyas causas genéticas subyacentes se desconocen. [ 13 ] El análisis de la estructura cromosómica de un paciente puede revelar cambios causales. Los nuevos métodos de biología molecular desarrollados en las últimas dos décadas, como la secuenciación de próxima generación y la secuenciación de ARN (RNA-seq), han reemplazado en gran medida a la citogenética molecular en el diagnóstico, pero recientemente el uso de derivados de FISH, como FISH multicolor y bandas multicolores (mBAND), ha ido en aumento en las aplicaciones médicas. [ 14 ]

Proyectos contra el cáncer

Uno de los proyectos actuales que involucran citogenética molecular involucra investigación genómica en cánceres raros, llamado Iniciativa de Caracterización del Genoma del Cáncer (CGCI) . [ 15 ] La CGCI es un grupo interesado en describir las anomalías genéticas de algunos cánceres raros, empleando secuenciación avanzada de genomas, exomas y transcriptomas, que en última instancia pueden jugar un papel en la patogénesis del cáncer. [ 15 ] Actualmente, la CGCI ha dilucidado algunas alteraciones genéticas previamente no determinadas en meduloblastoma y linfoma no Hodgkin de células B. Los próximos pasos para la CGCI son identificar alteraciones genómicas en tumores VIH+ y en linfoma de Burkitt .

Algunas técnicas de secuenciación de alto rendimiento que utiliza el CGCI incluyen: secuenciación del genoma completo , secuenciación del transcriptoma , secuenciación ChIP y Illumina Infinium MethylationEPIC BeadCHIP . [ 16 ]

Referencias

  1. ↑ Kearney L, Horsley SW (septiembre de 2005). " Citogenética molecular en neoplasias hematológicas: tecnología actual y perspectivas futuras". Chromosoma . 114 (4): 286– 94. doi : 10.1007/s00412-005-0002-z . PMID 16003502. S2CID 19251871 .  
  2. ↑ Bigner SH, Schröck E (noviembre de 1997). "Citogenética molecular de los tumores cerebrales" . Journal of Neuropathology and Experimental Neurology . 56 (11): 1173–81 . doi : 10.1097/00005072-199711000-00001 . PMID 9370227 . 
  3. ↑ O'Connor C (2008). "Hibridación in situ por fluorescencia (FISH)" . Nature Education . 1 (1): 171.
  4. ↑ Martin EA, McFerran TA, eds. (2017). Diccionario de enfermería . Oxford University Press.
  5. 1 2 "Pruebas citogenéticas | DermNet NZ" . www.dermnetnz.org . Consultado el 2 de abril de 2020 .
  6. 1 2 Banerjee D (15 de enero de 2013). Hibridación genómica comparativa en microarrays : protocolos y aplicaciones . Nueva York: Humana Press. págs. 1–13 .  
  7. ↑ Pinkel D, Albertson DG (2005). "Hibridación genómica comparativa". Annual Review of Genomics and Human Genetics . 6 (1): 331– 54. doi : 10.1146/annurev.genom.6.080604.162140 . PMID 16124865 . 
  8. ↑ Trask BJ (octubre de 2002). " Citogenética humana: 46 cromosomas, 46 años y contando". Nature Reviews Genetics . 3 (10): 769–78 . doi : 10.1038/nrg905 . PMID 12360235. S2CID 1127220 .  
  9. ↑ Lucito R, Healy J, Alexander J, Reiner A, Esposito D, Chi M, et al. (octubre de 2003). " Análisis de microarrays de oligonucleótidos representativos: un método de alta resolución para detectar la variación del número de copias del genoma" . Genome Research . 13 (10): 2291–305 . doi : 10.1101/gr.1349003 . PMC 403708. PMID 12975311 .   
  10. ↑ Robson SC, Chitty LS, Morris S, Verhoef T, Ambler G, Wellesley DG, Graham R, Leader C, Fisher J, Crolla JA (febrero de 2017). "Evaluación de la hibridación genómica comparativa en microarrays en el diagnóstico prenatal de anomalías fetales: un estudio de cohorte multicéntrico con análisis de costos y evaluación de las preferencias de pacientes, profesionales de la salud y comisionados para la hibridación genómica comparativa en microarrays" . Efficacy and Mechanism Evaluation . 4 (1): 1– 104. doi : 10.3310/eme04010 . PMID 28182369 . 
  11. 1 2 Rao PH, Nandula SV, Murty VV (2007). "Aplicaciones de la citogenética molecular en el análisis del genoma del cáncer". En Fisher PB (ed.). Genómica y proteómica del cáncer: métodos y protocolos . Métodos en biología molecular. Vol. 383. Humana Press. pp. 165–85 . doi : 10.1007/978-1-59745-335-6_11 . ISBN   9781597453356. PMID 18217685 . 
  12. ↑ Wan TS (2017). "Citogenética del cáncer: una introducción". En Wan TS (ed.). Citogenética del cáncer . Métodos en biología molecular. Vol. 1541. Springer New York. pp. 1–10 . doi : 10.1007/978-1-4939-6703-2_1 . ISBN   9781493967018. PMID 27910009 . 
  13. ↑ Speicher MR, Carter NP (octubre de 2005). " La nueva citogenética: difuminando los límites con la biología molecular". Nature Reviews Genetics . 6 (10): 782– 92. doi : 10.1038/nrg1692 . PMID 16145555. S2CID 15023775 .  
  14. ↑ Balajee AS, Hande MP (diciembre de 2018). "Historia y evolución de las técnicas citogenéticas: aplicaciones actuales y futuras en la investigación básica y clínica" . Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis . En memoria del profesor Adayapalam T Natarajan. 836 (Pt A): 3–12 . doi : 10.1016/j.mrgentox.2018.08.008 . PMID 30389159. S2CID 53274124 .  
  15. 1 2 GenomeOC (18 de enero de 2013). "Iniciativa de caracterización del genoma del cáncer" . Oficina de Genómica del Cáncer . Recuperado el 5 de octubre de 2019 .
  16. ↑ "GenomeOC Research" . Oficina de Genómica del Cáncer . 4 de febrero de 2013. Consultado el 5 de octubre de 2019 .
  • Recursos de citogenética
  • Citogenética humana: cromosomas y cariotipos
  • Asociación de Tecnólogos Genéticos
  • Asociación de Citogenetistas Clínicos
  • Citogenética: tecnologías, mercados y empresas
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