Muconate lactonizing enzyme

Muconate lactonizing enzymes (EC5.5.1.1, muconate cycloisomerase I, cis,cis-muconate-lactonizing enzyme, cis,cis-muconate cycloisomerase, 4-carboxymethyl-4-hydroxyisocrotonolactone lyase (decyclizing), CatB, MCI, MLE, 2,5-dihydro-5-oxofuran-2-acetate lyase (decyclizing)) are involved in the breakdown of lignin-derived aromatics, catechol and protocatechuate, to citric acid cycle intermediates as a part of the β-ketoadipate pathway in soil microbes. Some bacterial species are also capable of dehalogenatingchloroaromatic compounds by the action of chloromuconate lactonizing enzymes. MLEs consist of several strands which have variable reaction favorable parts therefore the configuration of the strands affect its ability to accept protons.^[1] The bacterial MLEs belong to the enolase superfamily, several structures from which are known.^[2][3][4] MLEs have an identifying structure made up of two proteins and two Magnesium ions as well as various classes depending on whether it is bacterial or eukaryotic.^[5][6]  The reaction mechanism that MLEs undergo are the reverse of beta-elimination in which the enolate alpha-carbon is protonated.^[7] MLEs can undergo mutations caused by a deletion of catB structural genes which can cause some bacteria to lose its functions such as the ability to grow.^[8] Additional mutations to MLEs can cause its structure and function to alter and could cause the conformation to change therefore making it an inactive enzyme that is unable to bind its substrate.^[1] There is another enzyme called Mandelate Racemase that is very similar to MLEs in the structural way as well as them both being a part of the enolase superfamily. They both have the same end product even though they undergo different chemical reactions in order to reach the end product.^[9][10]

La estructura de las enzimas lactonizantes de muconato (MLE) consiste en una hélice beta de siete aspas con diversas modificaciones según el tipo de clase a la que pertenecen. Existen tres clases de MLE: las MLE bacterianas, las CMLE bacterianas y las MLE/CMLE eucariotas. Las MLE bacterianas están formadas por un barril TIM y se organizan en la estereoquímica Syn, mientras que las CMLE bacterianas se organizan en la estereoquímica Anti. En cuanto a las MLE/CMLE eucariotas, se organizan en la estereoquímica Syn. Las MLE/CMLE eucariotas no han mostrado similitud de secuencia con ninguna otra familia de enzimas, pero se ha descubierto que las MLE bacterianas son similares a la superfamilia de la enolasa, y las CMLE bacterianas son similares a las fumarasas de clase II. ^{[ 6 ]}

La estructura en sí consta de dos moléculas de proteína que consisten en una cadena de aminoácidos y dos sustancias químicas que son los dos iones de magnesio. ^{[ 5 ]}

A gran escala, las MLE catalizan las vías bacterianas del β-cetoadipato catabolizando la lignina aromática presente en las plantas a intermediarios del ciclo de Krebs. Algunas MLE pueden ser halogenadas con Cl y desempeñan funciones ligeramente diferentes en el microorganismo. Las MLE halogenadas pueden eliminar el Cl de los aromáticos halogenados, permitiendo la descomposición del 2,4-diclorofenoxiacetato. Esta función única permite que estos microorganismos se utilicen en biorremediación, disminuyendo la toxicidad en suelos infestados con herbicidas. ^{[ 1 ]} Más específicamente, las MLE tienen múltiples cadenas. Algunas cadenas contienen porciones más favorables a la reacción según el análisis de mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM). La segunda cadena de la MLE contiene un residuo básico que permite la aceptación de protones en la Lys-162 o Lys-168 dependiendo de su configuración, anti o syn respectivamente. Se sostiene que los residuos básicos de la segunda hebra se utilizan en la formación de una superficie de energía en comparación con la sexta hebra. Las MLE encontradas en Mycobacterium smegmatis son anti-MLE, lo que significa que producen un antiproducto de muconolactona (lactona de muconato), mientras que Pseudomonas fluorescens utiliza syn-MLE para producir un synproducto. ^{[ 11 ]}

Las enzimas lactonizantes de muconato (MLE) presentan un mecanismo de reacción opuesto al de la mandelato racemasa (MR), siendo la reacción inversa a la beta-eliminación. Por lo tanto, un carbono alfa del enolato se protona en lugar de desprotonarse. Esta protonación es un paso termodinámicamente favorable en la reacción. Asimismo, al igual que en la MR, en las MLE la formación del intermedio enolato sigue siendo el problema catalítico central, constituyendo así la etapa limitante de la velocidad. Además, las MLE pueden facilitar la catálisis mediante la unión del sustrato, aumentando así la nucleofilicidad del carboxilato para producir lactona. ^{[ 11 ]}

La acción de la enzima lactonizante de muconato cataliza la misma reacción de adición-eliminación 1,2. Esto puede ocurrir con o sin un cofactor metálico. En los microorganismos del suelo, los muconatos cis,cis (sustrato) se convierten en muconolactonas (producto) por acción de las enzimas lactonizantes de muconato (MLE). Esta reacción química forma parte de la vía del β-cetoadipato, una vía catabólica aeróbica que degrada compuestos aromáticos como la lignina en un intermediario del ciclo del ácido cítrico. La vía del β-cetoadipato tiene dos ramas principales  : 1) la rama del catecol y 2) la rama del protocatecuato. La rama del catecol está formada por la enzima lactonizante de muconato cis,cis , mientras que la rama del protocatecuato está formada por la enzima lactonizante de muconato carboxi-cis,cis. Ambas reacciones generan succinato + acetil-CoA, que da paso al ciclo del ácido cítrico. ^{[ 6 ]} Por otro lado, la mandelato racemasa actúa catalizando la inversión de la configuración en el carbono alfa mediante la creación de un intermedio carbaniónico. ^{[ 12 ]}

La mutación en la enzima lactonizante de mucanoto puede deberse a la deleción en el gen estructural catB y a la pérdida de las actividades pleiotrópicas de los genes catB y catC  . ^{[ 8 ]}  Un microorganismo llamado Pseudomona putida pierde su capacidad de crecimiento debido a la deleción en el gen catB de la enzima lactonizante de muconato. Pseudomona putida  (un mutante sensible al frío) normalmente crece a 30 °C, pero debido a la mutación de la enzima lactonizante de cis,cis-muconato, pierde su capacidad de crecer también a 15 °C. A baja temperatura, la enzima mutante no pierde su función, sino que el gen estructural que codifica esa enzima en particular pierde su capacidad de expresarse a esa temperatura. ^{[ 13 ]}

Además, la mutación también puede conducir al cambio en la estructura y función de la enzima. La estructura diferente que resulta de la mutación en la enzima lactonizante de muconato es la enzima lactonizante de Cl-muconato. La enzima lactonizante de Cl-muconato tiene dos tipos de conformaciones  : abierta y cerrada. ^{[ 1 ]} La mutación produce el cambio de un aminoácido a Ser99 y este se une por enlaces de hidrógeno a Gly48. La estructura resultante tiene un sitio activo cerrado. Por lo tanto, este cambio de la enzima lactonizante de muconato a la enzima lactonizante de Cl-muconato produce diferencias dinámicas en la capacidad de unión del sitio activo. Finalmente, un cambio en la capacidad de unión impedirá que la reacción de deshalogenación continúe. Un aspecto importante a tener en cuenta es que no puede haber un cambio conformacional de Gly48 a Thr52. Esto se debe a que el polipéptido no podrá girar si se reemplaza Gly48. Además, Thr52 y Glu50 están unidos por enlaces de hidrógeno. ^{[ 7 ]}

Un cambio adicional en la conformación debido a la mutación de la enzima lactonizante de muconato puede dar lugar a un bucle 21-30. Esto puede generar una diferencia importante en los sitios activos, ya que evidencia la diferencia en la polaridad de un aminoácido. En la enzima lactonizante de muconato Cl- , Ile19 y Met21 son menos polares en comparación con His22 (en la misma posición que Ile19) en la enzima lactonizante de muconato . Por lo tanto, esto resulta en una diferencia en la estructura del núcleo hidrofóbico en el sitio activo.

Las enzimas son muy específicas para sus sustratos y la formación del producto depende de la actividad enzima-sustrato. La mutación puntual que dio lugar a las variantes Ser271Ala e Ile54Val para la enzima Cl-muconante mostró una disminución significativa en la actividad de deshalogenación. ^{[ 1 ]} Una ventaja de la mutación en la enzima lactonizante de muconato de Asp a Asn o de Glu a Gln es que puede ayudar a comprender el efecto del ligando metálico en el proceso catalítico y el sitio de unión.

La mandelato racemasa guarda una estrecha relación con las enzimas lactonasas de muconato. Si bien ambas enzimas catalizan reacciones químicas diferentes necesarias para los procesos catabólicos de Pseudomonas putida , su estructura es muy similar. Según la revista Nature International Journal of Science, ambas enzimas presentan un 26 % de identidad en su estructura primaria. Esta homología estructural se atribuye a un ancestro común, lo que permite modificar las actividades enzimáticas en las vías metabólicas. ^{[ 9 ]}

Según el libro « Mecanismo enzimático» , de Perry A. Frey y Dexter B. Northrop, las enzimas lactonizantes de muconato y la mandelato racemasa pertenecen a la superfamilia de las enolasas. Si bien ambas enzimas difieren en sus reacciones químicas, ambas generan el mismo producto final: la extracción de un protón de un carbono alfa para formar un ion carboxilato. Una de las ventajas de la similitud estructural entre estas dos enzimas es la posibilidad de generar una alineación estructural de alta calidad que puede contribuir a mejorar su composición y aumentar la velocidad de reacción. ^{[ 10 ]}

La siguiente tabla ayuda a identificar algunas de las similitudes entre ambas enzimas  :

Si bien las similitudes son muy notables, las diferencias entre estas dos enzimas permiten comprender las diferencias en el empaquetamiento de la enzima en forma cristalina. La siguiente tabla ayuda a identificar algunas de las diferencias entre ambas enzimas  :

• cis,cis-muconato+enzima+lactonizante en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .