Prueba genética

Un cribado genético o de mutagénesis es una técnica experimental utilizada para identificar y seleccionar individuos que poseen un fenotipo de interés en una población mutagenizada. ^{[ 1 ]} Por lo tanto, un cribado genético es un tipo de cribado fenotípico . Los cribados genéticos pueden proporcionar información importante sobre la función de los genes , así como sobre los eventos moleculares que subyacen a un proceso o vía biológica. Si bien los proyectos genómicos han identificado un extenso inventario de genes en muchos organismos diferentes, los cribados genéticos pueden proporcionar información valiosa sobre cómo funcionan esos genes. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

La genética directa (o un cribado genético directo) parte de un fenotipo y luego intenta identificar la mutación causante y, por lo tanto, el o los genes responsables del fenotipo. Por ejemplo, el famoso cribado de Christiane Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus mutagenizó moscas de la fruta y luego se propuso encontrar los genes que causaban los fenotipos mutantes observados. ^{[ 7 ]}

Los cribados genéticos directos exitosos suelen requerir un trasfondo genético definido y un procedimiento experimental sencillo. Es decir, cuando se mutagenizan varios individuos, estos deben ser genéticamente idénticos para que su fenotipo de tipo silvestre también lo sea y los fenotipos mutantes sean más fáciles de identificar. Un método de cribado sencillo permite analizar un mayor número de individuos, aumentando así la probabilidad de generar e identificar mutantes de interés. ^{[ 3 ]}

Dado que las mutaciones alélicas naturales son raras antes del cribado, los genetistas suelen mutagenizar una población de individuos exponiéndolos a un mutágeno conocido , como una sustancia química o radiación, generando así una frecuencia mucho mayor de mutaciones cromosómicas . ^{[ 1 ]} En algunos organismos, los mutágenos se utilizan para realizar cribados de saturación , es decir, un cribado utilizado para descubrir todos los genes implicados en un fenotipo particular. Christiane Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus fueron los primeros en realizar este tipo de procedimiento de cribado en animales. ^{[ 8 ]}

La genética inversa (o cribado genético inverso) parte de un gen conocido y analiza el efecto de su interrupción mediante el estudio de los fenotipos resultantes. Por ejemplo, en un cribado de eliminación génica, se eliminan por completo uno o más genes y se analizan los fenotipos de los mutantes resultantes. Estos cribados se han realizado para todos los genes de muchas bacterias e incluso organismos complejos, como C. elegans . ^{[ 1 ]} Un cribado genético inverso generalmente comienza con una secuencia genética seguida de una inactivación dirigida. ^{[ 9 ]} Además, induce mutaciones en organismos modelo para comprender su papel en las enfermedades. ^{[ 10 ]} La genética inversa también se utiliza para proporcionar estadísticas extremadamente precisas sobre las mutaciones que ocurren en genes específicos. A partir de estos cribados, se puede determinar cuán fortuitas son las mutaciones y con qué frecuencia ocurren. ^{[ 11 ]}

Se han ideado muchas variantes de cribado para dilucidar un gen que conduce a un fenotipo mutante de interés. Otra variante importante es el cribado sintético-letal , que busca pares de mutaciones que son viables individualmente pero letales en combinación y puede revelar genes que actúan en vías redundantes o paralelas. ^{[ 12 ] [ 13 ]} === Potenciador ===

Un cribado de potenciadores comienza con un individuo mutante que presenta un proceso de interés afectado por una mutación genética conocida. El cribado puede utilizarse para identificar genes o mutaciones genéticas adicionales que intervienen en dicho proceso biológico o fisiológico. Un cribado de potenciadores genéticos identifica mutaciones que potencian un fenotipo de interés en un individuo ya mutante. El fenotipo del mutante doble (individuo con la mutación potenciadora y la mutación de fondo original) es más prominente que cualquiera de los fenotipos de los mutantes simples. La potenciación debe superar los fenotipos esperados de las dos mutaciones por separado, por lo que cada mutación puede considerarse un potenciador de la otra. El aislamiento de mutantes potenciadores puede conducir a la identificación de genes que interactúan o que actúan de forma redundante entre sí. ^{[ 14 ]}

ARN de interferencia

El cribado de interferencia de ARN (ARNi) es esencialmente un cribado genético directo que utiliza una técnica de genética inversa. Al igual que los cribados genéticos clásicos del pasado, el éxito de los estudios de ARNi a gran escala depende del desarrollo cuidadoso de ensayos fenotípicos y su interpretación. ^{[ 9 ]} En Drosophila , el ARNi se ha aplicado en células cultivadas o in vivo para investigar las funciones génicas y afectar la función de genes individuales a escala genómica. El ARNi se utiliza para silenciar la expresión génica en Drosophila mediante la inyección de ARN bicatenario en embriones tempranos, e interfiriendo con los genes Frizzled y Frizzled2, lo que crea defectos en el patrón embrionario que imitan la pérdida de la función wingless. ^{[ 17 ]}

CRISPR

CRISPR/Cas se utiliza principalmente para cribados genéticos inversos. CRISPR tiene la capacidad de crear bibliotecas de miles de mutaciones genéticas precisas y puede identificar nuevos tumores, así como validar tumores antiguos en la investigación del cáncer. La biblioteca de inactivación génica a escala genómica CRISPR-Cas9 (GeCKO), dirigida a 18.080 genes con 64.751 secuencias guía únicas, identifica genes esenciales para la viabilidad celular en el cáncer. El sistema bacteriano CRISPR-Cas9 se utiliza para generar mutaciones de pérdida de función (LOF) y ganancia de función (GOF) en organoides intestinales humanos no transformados con el fin de demostrar un modelo de cáncer colorrectal (CCR) . También puede utilizarse para estudiar las consecuencias funcionales de las mutaciones in vivo, permitiendo la edición directa del genoma en células somáticas. ^{[ 10 ]}

Según el enfoque de la genética clásica , un investigador localizaría (mapearía) el gen en su cromosoma mediante el cruce con individuos que portan otros rasgos inusuales y recopilando estadísticas sobre la frecuencia con la que se heredan juntos ambos rasgos. Los genetistas clásicos habrían utilizado rasgos fenotípicos para mapear los nuevos alelos mutantes . Con la llegada de las secuencias genómicas para sistemas modelo como Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana y C. elegans, se han identificado muchos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que pueden utilizarse como rasgos para el mapeo. De hecho, el cribado de Heidelberg , que permite la prueba masiva de mutantes y fue desarrollado en 1980 por Nüsslein-Volhard y Wieschaus , allanó el camino para futuros científicos en este campo. ^{[ 4 ]} Los SNP son los rasgos preferidos para el mapeo, ya que son muy frecuentes, del orden de una diferencia por cada 1000 pares de bases, entre diferentes variedades de organismos. También se pueden utilizar mutágenos, como inserciones aleatorias de ADN por transformación o transposones activos, para generar nuevos mutantes. Estas técnicas tienen la ventaja de marcar los nuevos alelos con un marcador molecular (ADN) conocido que facilita la rápida identificación del gen. ^{[ 8 ]}

La clonación posicional es un método de identificación de genes en el que un gen responsable de un fenotipo específico se identifica únicamente por su ubicación cromosómica aproximada (pero no por su función); esta región se conoce como región candidata . Inicialmente, la región candidata se puede definir mediante técnicas como el análisis de ligamiento , y posteriormente se utiliza la clonación posicional para delimitar dicha región hasta encontrar el gen y sus mutaciones. La clonación posicional generalmente implica el aislamiento de segmentos de ADN parcialmente superpuestos a partir de bibliotecas genómicas para avanzar a lo largo del cromosoma hacia un gen específico. Durante el proceso de clonación posicional, es necesario determinar si el segmento de ADN que se está considerando forma parte del gen.

Las pruebas utilizadas para este propósito incluyen hibridación entre especies, identificación de islas CpG no metiladas , captura de exones , selección directa de ADNc , análisis computacional de secuencias de ADN, detección de mutaciones en individuos afectados y pruebas de expresión génica. Para genomas en los que se conocen las regiones de polimorfismos genéticos , la clonación posicional implica la identificación de polimorfismos que flanquean la mutación. Este proceso requiere que los fragmentos de ADN del marcador genético conocido más cercano se clonen y secuencien progresivamente, acercándose al alelo mutante con cada nuevo clon. Este proceso produce un mapa de contigs del locus y se conoce como recorrido cromosómico . Con la finalización de proyectos de secuenciación del genoma como el Proyecto Genoma Humano , la clonación posicional moderna puede utilizar contigs prefabricados directamente de las bases de datos de secuencias del genoma.

Para cada nuevo clon de ADN, se identifica un polimorfismo y se analiza su frecuencia de recombinación en la población de mapeo , comparándola con el fenotipo mutante. Cuando el clon de ADN se encuentra en el alelo mutante o cerca de él, la frecuencia de recombinación debería ser cercana a cero. Si el análisis cromosómico continúa a través del alelo mutante, los nuevos polimorfismos comenzarán a mostrar un aumento en la frecuencia de recombinación en comparación con el fenotipo mutante. Dependiendo del tamaño de la población de mapeo, el alelo mutante puede delimitarse a una pequeña región (<30 kb). Posteriormente, se requiere una comparación de secuencias entre el ADN de tipo silvestre y el mutante en esa región para localizar la mutación de ADN que causa la diferencia fenotípica.

La clonación posicional moderna permite extraer información de forma más directa de proyectos de secuenciación genómica y datos existentes mediante el análisis de los genes en la región candidata. De esta manera, se pueden priorizar los genes potencialmente causantes de enfermedades en dicha región, lo que reduce la carga de trabajo. Los genes con patrones de expresión consistentes con el fenotipo de la enfermedad, que muestran una función (putativa) relacionada con el fenotipo o que son homólogos a otro gen vinculado al fenotipo, son candidatos prioritarios. Esta generalización de las técnicas de clonación posicional se conoce también como descubrimiento de genes posicionales.

La clonación posicional es un método eficaz para aislar genes causantes de enfermedades de forma imparcial y se ha utilizado para identificar genes relacionados con la distrofia muscular de Duchenne , la enfermedad de Huntington y la fibrosis quística . Sin embargo, surgen complicaciones en el análisis si la enfermedad presenta heterogeneidad de locus.

• Principios de la clonación posicional o basada en mapas genéticos de genes vegetales
• Nature Reviews - Enfoque en genética: El arte y el diseño de las pruebas genéticas