UÑA-MS

NAIL-MS (abreviatura de espectrometría de masas acoplada al marcaje isotópico de ácidos nucleicos ) es una técnica basada en la espectrometría de masas que se utiliza para la investigación de los ácidos nucleicos y sus modificaciones . Permite diversos diseños experimentales para estudiar el mecanismo subyacente de la biología del ARN in vivo . Por ejemplo, se puede seguir con mayor detalle el comportamiento dinámico de los ácidos nucleicos en células vivas, especialmente las modificaciones del ARN . ^{[ 1 ]}

La técnica NAIL-MS se utiliza para estudiar los mecanismos de modificación del ARN. Para ello, las células en cultivo se alimentan primero con nutrientes marcados con isótopos estables, que las células incorporan a sus biomoléculas. Tras la purificación de los ácidos nucleicos, generalmente ARN , se realiza un análisis mediante espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una técnica analítica que mide la relación masa-carga de los iones . En un espectrómetro de masas, se pueden diferenciar pares de nucleósidos químicamente idénticos con diferente composición isotópica estable debido a su diferencia de masa. Por lo tanto, los nucleósidos no marcados se pueden distinguir de sus isotopólogos marcados con isótopos estables . Para la mayoría de los métodos NAIL-MS, es crucial que los nucleósidos marcados sean más de 2 Da más pesados ​​que los no marcados. Esto se debe a que el 1,1 % de los átomos de carbono presentes en la naturaleza son isótopos de ^13C . En el caso de los nucleósidos, esto conlleva un aumento de masa de 1 Da en aproximadamente el 10 % de los nucleósidos. Esta señal perturbaría la evaluación final de la medición.

La técnica NAIL-MS permite investigar la dinámica de modificación del ARN mediante el cambio de los nutrientes marcados del medio de cultivo correspondiente durante el experimento. Además, permite comparar directamente poblaciones celulares sin sesgos de purificación. Asimismo, se puede utilizar para la producción de isotopólogos biosintéticos de la mayoría de los nucleósidos, necesarios para su cuantificación mediante espectrometría de masas e incluso para el descubrimiento de modificaciones del ARN aún desconocidas. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

En general, las células se cultivan en medios sin marcar o marcados con isótopos estables (no radiactivos). Por ejemplo, el medio puede contener glucosa marcada con seis átomos de carbono-13 ( ^¹³C ) en lugar del carbono-12 habitual ( ^¹²C ). Dependiendo del organismo modelo, las células que crecen en este medio incorporarán la glucosa pesada a todas sus moléculas de ARN. Posteriormente, todos los nucleótidos serán 5 Da más pesados ​​que sus isótopos sin marcar debido al marcaje completo de la ribosa con carbono. Tras el cultivo y el marcaje adecuado de las células, estas se recolectan generalmente mediante fenol/cloroformo/isotiocianato de guanidinio. Existen otros métodos de extracción posibles y, en ocasiones, necesarios (por ejemplo, para levaduras). El ARN se aísla mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con isopropanol . La purificación adicional de especies específicas de ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt) se realiza habitualmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), aunque también existen otros métodos. Para la mayoría de las aplicaciones, el producto final necesita ser digerido enzimáticamente a nucleósidos antes del análisis por LC-MS . Por lo tanto, se utilizan enzimas de digestión como benzonasa , NP1 y CIP . ^{[ 5 ] [ 6 ]} Normalmente, se utiliza un triple cuadrupolo en modo MRM para las mediciones.

La forma en que se logra el marcaje de las moléculas de ARN depende del organismo modelo. Para E. coli ( bacteria ), se puede usar el medio mínimo M9 y complementarlo con variantes marcadas con isótopos estables de las sales necesarias. Esto permite el marcaje con ^13C -carbono, ^15N -nitrógeno, ^34S -azufre y ^2H -hidrógeno. ^{[ 7 ]} En S. cerevisiae ( levadura ), actualmente existen dos posibilidades: primero, el uso de un medio de cultivo completo disponible comercialmente, que permite el marcaje con ^13C -carbono y/o ^15N -nitrógeno, y segundo, el uso del medio mínimo YNB, que debe complementarse con varios aminoácidos y glucosa que pueden agregarse como variantes marcadas con isótopos estables para lograr el marcaje de ^13C -carbono, ^15N -nitrógeno y ^2H -hidrógeno del ARN. ^{[ 8 ]}

Si bien el marcaje en organismos modelo como E. coli y S. cerevisiae es bastante simple, el marcaje con isótopos estables en cultivos celulares es mucho más complejo debido a la mayor complejidad de la composición de los medios de cultivo. Ni la suplementación con glucosa marcada con isótopos estables ni la suplementación con variantes marcadas con isótopos estables de precursores simples de la biosíntesis de nucleósidos, como la glutamina y/o el aspartato, son suficientes para un aumento de masa definido superior a 2 Da. En cambio, la mayoría de las células mantenidas en cultivo celular pueden alimentarse con metionina marcada con isótopos estables para el marcaje de grupos metilo y con variantes marcadas con isótopos estables de adenina y uridina para el marcaje del cuerpo base del nucleósido. ^{[ 9 ]} Se debe tener especial cuidado al suplementar el medio con FBS (suero fetal bovino), ya que también contiene pequeños metabolitos utilizados para la biosíntesis de nucleósidos. Por lo tanto, se recomienda el uso de FBS dializado cuando se desea un marcaje definido de todos los nucleósidos.

Con NAIL-MS son posibles diferentes diseños experimentales.

• https://www.cup.lmu.de/oc/kellner/research/
• https://iimcb.genesilico.pl/modomics/