Prueba de ácido nucleico

Una prueba de ácidos nucleicos ( NAT ) es una técnica que se utiliza para detectar directamente una secuencia específica de ácido nucleico , generalmente para detectar e identificar una especie o subespecie particular de organismo, a menudo un virus o bacteria que actúa como patógeno en sangre , tejido , orina , etc. Las NAT se diferencian de otras pruebas en que detectan material genético ( ARN o ADN ) en lugar de antígenos o anticuerpos . La detección de material genético permite un diagnóstico temprano de una enfermedad porque la detección de antígenos y/o anticuerpos requiere tiempo para que comiencen a aparecer en el torrente sanguíneo. ^{[ 1 ]} Dado que la cantidad de cierto material genético suele ser muy pequeña, muchas NAT incluyen un paso que amplifica el material genético, es decir, hace muchas copias del mismo. Dichas NAT se denominan pruebas de amplificación de ácidos nucleicos ( NAAT ). Existen varias formas de amplificación, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ensayo de desplazamiento de cadena (SDA), el ensayo mediado por transcripción (TMA) ^{[ 2 ]} y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). ^{[ 3 ]}

Prácticamente todos los métodos de amplificación de ácidos nucleicos y las tecnologías de detección utilizan la especificidad del apareamiento de bases de Watson-Crick; las moléculas de sonda o cebador de cadena simple capturan moléculas diana de ADN o ARN de cadenas complementarias . Por lo tanto, el diseño de las cadenas de sonda es fundamental para aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Sin embargo, las mutaciones que constituyen la base genética de diversas enfermedades humanas suelen ser ligeramente diferentes de los ácidos nucleicos normales. A menudo, solo difieren en una base, por ejemplo, inserciones , deleciones y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). En este caso, puede producirse fácilmente una unión imperfecta entre la sonda y la diana, lo que da lugar a falsos positivos, como confundir una cepa comensal con una patógena. Se ha dedicado mucha investigación a lograr la especificidad de una sola base .

Las cadenas de ácido nucleico (ADN y ARN) con secuencias correspondientes se unen formando pares de cadenas. Sin embargo, cada nodo de la cadena no es muy adhesivo, por lo que la cadena de doble hebra se desenrolla y se vuelve a enrollar continuamente bajo la influencia de las vibraciones ambientales (conocidas como ruido térmico o movimiento browniano ). Los pares más largos son más estables. Las pruebas de ácido nucleico utilizan una "sonda", que es una hebra larga con una hebra corta unida a ella. La hebra cebadora larga tiene una secuencia correspondiente (complementaria) a una hebra "objetivo" del organismo causante de la enfermedad que se está detectando. La hebra causante de la enfermedad se adhiere firmemente a la parte expuesta de la hebra cebadora larga (llamada "punto de anclaje") y, poco a poco, desplaza la hebra corta "protectora" de la sonda. Finalmente, la hebra corta protectora no está unida a nada y la hebra corta cebadora libre es detectable. El resto de esta sección describe la historia de la investigación necesaria para perfeccionar este proceso y convertirlo en una prueba útil.

En 2012, el grupo de investigación de Yin publicó un artículo sobre la optimización de la especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos. ^{[ 4 ]} Introdujeron una "sonda de intercambio de anclaje (PC)" que consta de una hebra complementaria pre-hibridada C y una hebra protectora P. La hebra complementaria es más larga que la hebra protectora para tener una cola libre en el extremo, un anclaje. La hebra complementaria es perfectamente complementaria con la secuencia objetivo. Cuando el objetivo correcto (X) reacciona con la sonda de intercambio de anclaje (PC), P se libera y se forma el producto hibridado XC. La energía libre estándar (∆) de la reacción es cercana a cero. Por otro lado, si la sonda de intercambio de anclaje (PC) reacciona con un objetivo espurio (S), la reacción se produce en sentido directo, pero la energía libre estándar aumenta, siendo menos favorable termodinámicamente. La diferencia de energía libre estándar (∆∆) es lo suficientemente significativa como para proporcionar una discriminación clara en el rendimiento. El factor de discriminación Q se calcula como el rendimiento de la hibridación del objetivo correcto dividido por el rendimiento de la hibridación del objetivo espurio. Mediante experimentos con diferentes sondas de intercambio de anclaje con 5 objetivos correctos y 55 objetivos espurios con cambios de una sola base energéticamente representativos (sustituciones, deleciones e inserciones), el grupo de Yin concluyó que los factores de discriminación de estas sondas oscilaban entre 3 y 100+, con una mediana de 26. Las sondas funcionan de forma robusta desde 10  °C hasta 37  °C, desde 1 mM hasta 47 mM y con concentraciones de ácido nucleico desde 1 nM hasta 5 M. También descubrieron que las sondas de intercambio de anclaje funcionan de forma robusta incluso en la detección de ARN.

Posteriormente se realizaron más investigaciones. En 2013, el grupo de Seelig publicó un artículo sobre sondas moleculares fluorescentes que también utilizan la reacción de intercambio de anclaje. ^{[ 5 ]} Esto permitió la detección óptica del objetivo correcto y del objetivo SNP. También lograron detectar SNP en muestras derivadas de E. coli.

En 2015, el grupo de David logró una selectividad extremadamente alta (más de 1000) de variantes de un solo nucleótido (SNV) mediante la introducción del sistema denominado "composiciones competitivas". ^{[ 6 ]} En este sistema, construyeron un modelo de reacción cinética de los procesos de hibridación subyacentes para predecir los valores óptimos de los parámetros, que varían según las secuencias de SNV y de tipo silvestre (WT), la arquitectura de diseño de la sonda y el sumidero, y las concentraciones de reactivos y las condiciones del ensayo. Su modelo logró una selectividad media de 890 veces para 44 SNV de ADN relacionados con el cáncer, con un mínimo de 200, lo que representa una mejora de al menos 30 veces con respecto a los ensayos previos basados ​​en hibridación. Además, aplicaron esta tecnología para analizar secuencias de baja frecuencia alélica variante (VAF) del ADN genómico humano después de la PCR, así como directamente a secuencias de ARN sintético.

Basándose en su experiencia, desarrollaron un nuevo método de PCR llamado Amplificación por Desplazamiento de Bloqueadores (BDA). ^{[ 7 ]} Se trata de una PCR robusta a la temperatura que amplifica selectivamente todas las variantes de secuencia dentro de una ventana de aproximadamente 20 nt por 1000 veces con respecto a las secuencias de tipo silvestre, lo que permite la fácil detección y cuantificación de cientos de variantes potenciales originalmente con una frecuencia alélica ≤ 0,1 %. BDA logra un rendimiento de enriquecimiento similar en temperaturas de hibridación que van desde 56  °C hasta 64  °C. Esta robustez a la temperatura facilita el enriquecimiento multiplexado de muchas variantes diferentes en todo el genoma y, además, permite el uso de instrumentos de termociclado económicos y portátiles para la detección de variantes de ADN raras. BDA ha sido validado incluso en tipos de muestras que incluyen muestras clínicas de ADN libre de células recolectadas del plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón.

• Diagnóstico de infecciones gonocócicas y otras infecciones por Neisseria: amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN de N. gonorrhoeae para su detección. ^{[ 2 ]}
• Diagnóstico de infecciones urogenitales por C. trachomatis ^{[ 8 ]}
• Detección de Mycobacterium tuberculosis ^{[ 9 ]}
• Detección de ARN o ADN del VIH ^{[ 10 ]}
• Detección de coronavirus zoonóticos ^{[ 11 ]}
• Prueba diagnóstica para SARS-CoV-2 ^{[ 12 ]}
• Detección de bacterias resistentes a los antibióticos tras el tratamiento con antibióticos ^{[ 13 ]}