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Fosforamidita de nucleósido

Fosforamiditas de 2'-desoxinucleósido protegidas. Las fosforamiditas de nucleósidos son derivados de nucleósidos naturales o sintéticos . Se utilizan para sintetizar oligonucleó...

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Fosforamiditas de 2'-desoxinucleósido protegidas.

Las fosforamiditas de nucleósidos son derivados de nucleósidos naturales o sintéticos . Se utilizan para sintetizar oligonucleótidos , fragmentos relativamente cortos de ácido nucleico y sus análogos . Las fosforamiditas de nucleósidos fueron introducidas por primera vez en 1981 por Beaucage y Caruthers. [1] Para evitar reacciones secundarias no deseadas, los grupos hidroxi reactivos y amino exocíclicos presentes en nucleósidos naturales o sintéticos se protegen adecuadamente. Siempre que un análogo de nucleósido contenga al menos un grupo hidroxi, el uso de la estrategia de protección adecuada permite convertirlo en la fosforamidita respectiva e incorporar este último en ácidos nucleicos sintéticos. Para incorporarse en el medio de una cadena de oligonucleótidos utilizando la estrategia de fosforamidita, el análogo de nucleósido debe poseer dos grupos hidroxi o, con menor frecuencia, un grupo hidroxi y otro grupo nucleofílico (amino o mercapto). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, nucleótidos alternativos , LNA , morfolino , nucleósidos modificados en la posición 2' (OMe, NH2 protegido , F), nucleósidos que contienen bases no canónicas ( hipoxantina y xantina contenidas en los nucleósidos naturales inosina y xantosina , respectivamente, bases tricíclicas como G-clamp, [2] etc.) o bases derivatizadas con un grupo fluorescente o un brazo enlazador.

Preparación

Hay tres métodos principales para la preparación de fosforamiditas de nucleósidos.

  • DMT = 4,4'-dimetoxitritilo; B = base nucleica opcionalmente protegida; R = grupo protector de fosfato
    El método común implica el tratamiento de un nucleósido protegido que lleva un solo grupo hidroxi libre con fosforodiamidita bajo la acción catalítica de un ácido débil. [3] [4] Aunque se informó que algunas bisamiditas eran compuestos térmicamente inestables, [5] la 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita, la amidita utilizada para preparar fosforamiditas de nucleósidos comerciales, es relativamente estable. Se puede sintetizar utilizando un procedimiento de dos pasos en un solo recipiente y purificarla por destilación al vacío . [6] Una excelente revisión describe el uso de este último reactivo en la preparación de fosforamiditas nucleosídicas y no nucleosídicas con gran detalle. [7]
  • En el segundo método, el nucleósido protegido se trata con el fosforocloridito en presencia de una base orgánica, más comúnmente N-etil-N,N-diisopropilamina (base de Hunig). [8]
  • En el tercer método, [9] el nucleósido protegido se trata primero con fosforodiamidita de cloro N,N,N',N'-tetraisopropilo en presencia de una base orgánica, más comúnmente N-etil-N,N-diisopropilamina (base de Hunig) para formar una diamidita de nucleósido protegida. Esta última se trata con un alcohol correspondiente al grupo protector de fosfito deseado, por ejemplo, 2-cianoetanol, en presencia de un ácido débil.

Las fosforamiditas de nucleósidos se purifican mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice . Para garantizar la estabilidad de la fracción de fosforamidita, es aconsejable equilibrar la columna con un eluyente que contenga entre un 3 y un 5 % de trietilamina y mantener esta concentración en el eluyente durante todo el transcurso de la separación. La pureza de una fosforamidita se puede evaluar mediante espectroscopia de RMN de 31 P. Como el átomo de P(III) en una fosforamidita de nucleósido es quiral, muestra dos picos a aproximadamente 149 ppm correspondientes a los dos diastereómeros del compuesto. La impureza de triéster de fosfito potencialmente presente muestra un pico a 138-140 ppm. Las impurezas de H-fosfonato muestran picos a 8 y 10 ppm.

Propiedades químicas de la fracción fosforamidita

Las fosforamiditas de nucleósidos son compuestos relativamente estables con una vida útil prolongada cuando se almacenan como polvos en condiciones anhidras en ausencia de aire a temperaturas inferiores a 4 °C. Las amiditas resisten condiciones básicas suaves. Por el contrario, en presencia de ácidos suaves, las fosforamiditas perecen casi instantáneamente. Las fosforamiditas son relativamente estables a la hidrólisis en condiciones neutras. Por ejemplo, la vida media del fosfito de 2-cianoetilo 5'- O -(4,4'-dimetoxitritil) timidina -3'- O -(N,N-diisopropilamino) en acetonitrilo acuoso al 95% a 25 °C es de 200 h. [10]

  • X = O, S, NH.
    La característica más importante de las fosforamiditas es su capacidad para experimentar la reacción de acoplamiento de fosforamidita, es decir, reaccionar con grupos nucleofílicos en presencia de un catalizador azólico ácido, 1 H -tetrazol , 2-etiltiotetrazol, [11] 2-benciltiotetrazol, [12] [13] 4,5-diciano imidazol , [14] o varios compuestos similares. La reacción se produce de forma extremadamente rápida. Esta misma característica hace que las fosforamiditas de nucleósidos sean intermediarios útiles en la síntesis de oligonucleótidos . Estereoquímicamente, el acoplamiento de fosforamidita conduce a la epimerización (formación de diastereómeros ) en el centro quiral P(III).

Cuando se utiliza agua como nucleófilo, el producto es un diéster de H-fosfonato, como se muestra en el esquema anterior. Debido a la presencia de agua residual en los disolventes y reactivos, la formación de este último compuesto es la complicación más común en el uso preparativo de fosforamiditas, particularmente en la síntesis de oligonucleótidos.

  • X = S, Se.
    Las fosforamiditas se oxidan fácilmente con reactivos oxidantes débiles, por ejemplo, con yodo acuoso en presencia de bases débiles o con peróxido de hidrógeno [15] para formar los respectivos fosforamidatos.

De manera similar, las fosforamiditas reaccionan con otros calcógenos . Cuando entran en contacto con una solución de azufre [15] [16] o una serie de compuestos denominados colectivamente agentes sulfurantes , [17] [18] las fosforamiditas forman cuantitativamente fosforotioamidatos. La reacción con selenio [15] [16] o derivados de selenio [19] produce fosforoselenoamidatos. En todas las reacciones de este tipo, se conserva la configuración en el átomo de fósforo.

  • Los fosforamiditos de nucleósidos experimentan la reacción de Michaelis-Arbuzov para formar los respectivos fosfonamidatos. Un ejemplo describe la preparación de fosfonamidatos en presencia de acrilonitrilo . [20] Según se informa, a temperatura ambiente la reacción es estereoselectiva con la retención de la configuración en el centro de fósforo. Por el contrario, cuando se lleva a cabo a 55 °C, la reacción conduce a productos racemizados .
  • De manera similar a las fosfinas y los fosfitos terciarios, las fosforamiditas experimentan fácilmente la reacción de Staudinger .

(RO) 2P -N(R1 ) 2 + R2 - N3 + H2O ---- (RO) 2P (=O)-N( R1 ) 2 + R2 - NH2 + N2 ;

Estrategia de protección

Los nucleótidos naturales (nucleósidos-3'- o 5'-fosfatos) y sus análogos fosfodiésteres no son lo suficientemente reactivos para permitir una preparación sintética rápida de oligonucleótidos con altos rendimientos. La selectividad y la tasa de formación de enlaces internucleosídicos se mejoran drásticamente mediante el uso de derivados de nucleósidos 3'- O -( N , N -diisopropil fosforamidita) (fosforamiditas de nucleósidos) que sirven como bloques de construcción en la metodología de triésteres de fosfito. Para evitar reacciones secundarias no deseadas, todos los demás grupos funcionales presentes en los nucleósidos deben volverse no reactivos (protegidos) mediante la unión de grupos protectores . Una vez completado el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos, se eliminan todos los grupos protectores para producir los oligonucleótidos deseados. A continuación, se revisan brevemente los grupos protectores que se utilizan actualmente en los bloques de construcción de fosforamiditas de nucleósidos disponibles comercialmente [21] [22] [23] [24] [25] y los más comunes:

  • El grupo 5'-hidroxilo está protegido por un grupo DMT (4,4'-dimetoxitritilo) lábil a los ácidos.
  • La timina y el uracilo , bases nucleicas de la timidina y la uridina , respectivamente, no tienen grupos amino exocíclicos y, por lo tanto, no requieren protección alguna. Por el contrario, las bases nucleicas adenina , citosina y guanina tienen los grupos amino exocíclicos, que son reactivos con las fosforamiditas activadas en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Aunque, a expensas de pasos adicionales en el ciclo sintético, el ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos puede llevarse a cabo utilizando fosforamiditas con grupos amino desprotegidos, [26] la mayoría de las veces estos se mantienen protegidos permanentemente durante toda la longitud del ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos. La protección de los grupos amino exocíclicos debe ser ortogonal a la del grupo 5'-hidroxi porque este último se elimina al final de cada ciclo sintético. La más sencilla de implementar y, por lo tanto, la más ampliamente aceptada es la estrategia en la que los grupos amino exocíclicos tienen una protección lábil a las bases. La mayoría de las veces, se utilizan dos esquemas de protección.
  • En el primer esquema, el estándar y más robusto (Figura), se utiliza la protección Bz (benzoilo) para A, dA, C, dC, G y dG que se protegen con el grupo isobutirilo. Más recientemente, se utiliza a menudo el grupo Ac (acetilo) para proteger C y dC, como se muestra en la Figura. [27]
  • En el segundo esquema de protección suave, A y dA se protegen con grupos isobutirilo [28] o fenoxiacetilo (PAC). [29] C y dC llevan protección de acetilo, [27] y G y dG se protegen con grupos 4-isopropilfenoxiacetilo (i-Pr-PAC) [30] o dimetilformamidino (dmf) [31] . Los grupos protectores suaves se eliminan más fácilmente que los grupos protectores estándar. Sin embargo, las fosforamiditas que llevan estos grupos son menos estables cuando se almacenan en solución.
  • El grupo fosfito está protegido por un grupo 2-cianoetilo lábil a las bases . [32] Una vez que un fosforamidito se ha acoplado al oligonucleótido unido al soporte sólido y las fracciones de fosfito se han convertido en la especie P(V), la presencia de la protección de fosfato no es obligatoria para la realización exitosa de otras reacciones de acoplamiento. [33]
Fosforamiditas de ribonucleósido 2'- O -protegidas.
  • En la síntesis de ARN, el grupo 2'-hidroxi está protegido con el grupo TBDMS ( t -butildimetilsililo). [34] [35] [36] [37] o con el grupo TOM (tri- iso -propilsililoximetilo), [38] [39] ambos eliminables mediante tratamiento con ion fluoruro.
  • La fracción fosfito también contiene un grupo diisopropilamino ( i Pr 2 N) reactivo en condiciones ácidas. Al activarse, el grupo diisopropilamino se desprende y es sustituido por el grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido unido al soporte.

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

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