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Transfección óptica

La transfección óptica es una técnica biomédica que consiste en introducir ácidos nucleicos (es decir, material genético como el ADN ) en las células mediante luz. Todas las cél...

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La transfección óptica es una técnica biomédica que consiste en introducir ácidos nucleicos (es decir, material genético como el ADN ) en las células mediante luz. Todas las células están rodeadas por una membrana plasmática , que impide que muchas sustancias entren o salgan de la célula. Los láseres pueden utilizarse para perforar esta membrana, permitiendo así la entrada de sustancias. Esto resulta sumamente útil para los biólogos que estudian enfermedades, ya que un requisito experimental común es introducir elementos (como ADN) en las células.

Normalmente, se enfoca un láser en un punto limitado por difracción (~ 1  μm de diámetro) mediante un objetivo de microscopio de alta apertura numérica . La membrana plasmática de la célula se expone a esta luz altamente enfocada durante un breve periodo de tiempo (generalmente de decenas de milisegundos a segundos), generando un poro transitorio en la membrana. La formación de un fotoporo permite la entrada a la célula de ADN plasmídico exógeno , ARN , fluoróforos orgánicos u objetos de mayor tamaño, como nanopartículas cuánticas semiconductoras . Esta técnica permite el tratamiento de una célula a la vez, lo que la hace especialmente útil para el análisis de células individuales.

Esta técnica fue demostrada por primera vez en 1984 por Tsukakoshi et al., quienes utilizaron un Nd:YAG de frecuencia triplicada para generar una transfección estable y transitoria de células renales de rata normales. [ 1 ] Desde entonces, se ha demostrado la transfección óptica de una gran variedad de tipos de células de mamíferos utilizando diversas fuentes láser, incluyendo la  onda continua (cw) de 405 nm, [ 2 ] la cw de 488  nm, [ 3 ] o fuentes pulsadas como el  Ti:Zafiro pulsado de femtosegundos de 800 nm [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] o  el Nd:YAG pulsado de nanosegundos de 1064 nm. [ 14 ] [ 15 ]

Terminología

El significado del término transfección ha evolucionado. [ 16 ] El significado original de transfección era "infección por transformación", es decir , la introducción de ADN (o ARN) de un virus o bacteriófago que infecta a procariotas en las células, lo que resulta en una infección. Debido a que el término transformación tenía otro sentido en la biología de las células animales (un cambio genético que permite la propagación a largo plazo en cultivo o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerosas), el término transfección adquirió, para las células animales, su significado actual de un cambio en las propiedades celulares causado por la introducción de ADN (u otras especies de ácidos nucleicos como ARN o ARNip ).

Debido a esta estricta definición de transfección , la transfección óptica se refiere únicamente a la introducción de especies de ácidos nucleicos. La introducción de otros compuestos impermeables en una célula, como fluoróforos orgánicos o nanopartículas cuánticas semiconductoras , no se considera estrictamente "transfección" y, por lo tanto, se denomina "inyección óptica" o alguno de los muchos otros términos ya mencionados.

La falta de un nombre unificado para esta tecnología hace que la revisión de la literatura sobre el tema sea muy difícil. [ 17 ] La inyección óptica se ha descrito utilizando más de una docena de nombres o frases diferentes (ver listas con viñetas a continuación). Algunas tendencias en la literatura son claras. El primer término de la técnica es invariablemente una derivación de la palabra láser, óptico o foto, y el segundo término generalmente hace referencia a inyección, transfección, poración, perforación o punción. Como muchas perturbaciones celulares, cuando una sola célula o grupo de células es tratado con un láser, pueden ocurrir tres cosas: la célula muere (sobredosis), la membrana celular se permeabiliza, las sustancias entran y la célula se recupera (dosis terapéutica), o no ocurre nada (subdosis). En la literatura se ha sugerido reservar el término optoinyección para cuando se administra una dosis terapéutica a una sola célula, [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] y el término optoporación para cuando una onda de choque generada por láser trata un grupo de muchas (de decenas a cientos) células. [ 18 ] [ 19 ] [ 14 ] [ 20 ] La primera definición de optoinyección no genera controversia. Sin embargo, la definición de optoporación no ha sido adoptada, con un número similar de referencias que utilizan el término para denotar la dosificación de células individuales [ 3 ] [ 5 ] [ 15 ] [ 21 ] como las que utilizan el término para denotar la dosificación simultánea de grupos de muchas células [ 18 ] [ 19 ] [ 14 ] [ 20 ]

Tal como está el campo, es opinión de los autores de un artículo de revisión sobre el tema [ 17 ] que el término optoinyección siempre debe incluirse como palabra clave en futuras publicaciones, independientemente de sus propias preferencias de nomenclatura.

Términos acordados por consenso

  • Optoinyección (o cualquier derivado de inyección láser, inyección óptica, fotoinyección): Transferencia de cualquier sustancia impermeable a la membrana celular al interior de una célula mediante luz. Un término general que también abarca la transfección óptica.
  • Transfección óptica (o cualquier variante de transfección láser, optotransfección, fototransfección): Un tipo específico de transfección óptica es la transferencia de ácidos nucleicos a una célula mediante luz con el fin de inducir la síntesis de proteínas a partir de dichos ácidos. De acuerdo con la definición actual de transfección en la comunidad biológica, los ácidos no nucleicos (como los fluoróforos) no pueden, por definición, ser transfectados ópticamente (solo inyectados ópticamente).
  • Fotoporación (o cualquier derivación de [láser-], [óptico-], [opto-], [foto-] Y [poración], [permeabilización], [punción] o [perforación]): Generación de uno o varios orificios transitorios en la membrana plasmática (o pared celular) de una célula, generalmente con el propósito de inyección óptica. Véase posible excepción: Optoporación.
  • -cirugía (como nanocirugía celular, nanocirugía láser, cirugía láser): Un término general que incorpora todas las definiciones anteriores, pero también incluye los conceptos de ablación o manipulación óptica de material celular para otros fines además de la generación de poros. Los ejemplos incluyen la ablación celular selectiva para purificar poblaciones celulares, la disección cromosómica, la alteración del citoesqueleto, la ablación de orgánulos, la axotomía, [ 22 ] o la manipulación óptica o el aislamiento de material intracelular.

Términos en deliberación

  • Optoporación : Se ha sugerido que significa la dosificación de un grupo de células con un mecanismo mediado por ondas de choque, que generalmente resulta en una zona terapéutica en forma de rosquilla. [ 18 ] [ 19 ] [ 14 ] [ 20 ] Por el contrario, también se ha usado como sinónimo del término fotoporación. [ 3 ] [ 5 ] [ 15 ] [ 21 ]
  • Laserfection : Se ha sugerido que se refiere a la dosificación de un grupo de células con una zona terapéutica de forma circular. Término reservado para el sistema de análisis y procesamiento láser (LEAP) de Cyntellect.
  • Transporte transmembrana convectivo inducido por la luz : un término de reciente creación para la optoinyección. [ 23 ]

Parte de lo anterior se reprodujo con permiso de [ 17 ] .

Métodos

Un protocolo típico de transfección óptica es el siguiente: [ 11 ] 1) Construir un sistema de pinzas ópticas con un objetivo de alta apertura numérica (NA). 2) Cultivar las células hasta alcanzar una confluencia del 50-60%. 3) Exponer las células a al menos 10  μg/mL de ADN plasmídico. 4) Incidir en la membrana plasmática de cada célula un láser enfocado durante 10-40 ms, con una potencia inferior a 100  mW en el foco. 5) Observar la transfección transitoria 24-96 h después. 6) Añadir medio selectivo si se desea generar colonias estables.

Véase también

Referencias

  1. ↑ Tsukakoshi, M.; Kurata, S.; Nomiya, Y.; Ikawa, Y.; Kasuya, T. (1984). "Un nuevo método de transfección de ADN mediante cirugía celular con microhaz láser". Applied Physics B: Photophysics and Laser Chemistry . 35 (3). Springer Science and Business Media LLC: 135– 140. Bibcode : 1984ApPhB..35..135T . doi : 10.1007/bf00697702 . ISSN 0721-7269 . S2CID 123250337 .  
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  • Transfección en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • Descripción general de los métodos de transfección en Nature Methods 2, 875 - 883 (2005)