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Clonación molecular

Diagrama de clonación molecular utilizando bacterias y plásmidos. La clonación molecular es un conjunto de métodos experimentales en biología molecular que se utilizan para ensa...

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Diagrama de clonación molecular utilizando bacterias y plásmidos.

La clonación molecular es un conjunto de métodos experimentales en biología molecular que se utilizan para ensamblar moléculas de ADN recombinante y dirigir su replicación dentro de organismos huéspedes . [ 1 ] El término clonación se refiere al hecho de que el método implica la replicación de una molécula para producir una población de células con moléculas de ADN idénticas. La clonación molecular generalmente utiliza secuencias de ADN de dos organismos diferentes: la especie que es la fuente del ADN que se va a clonar y la especie que servirá como huésped vivo para la replicación del ADN recombinante. Los métodos de clonación molecular son fundamentales en muchas áreas contemporáneas de la biología y la medicina modernas. [ 2 ]

En un experimento convencional de clonación molecular, el ADN que se va a clonar se obtiene de un organismo de interés y se trata con enzimas en un tubo de ensayo para generar fragmentos de ADN más pequeños. Posteriormente, estos fragmentos se combinan con ADN vector para generar moléculas de ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en un organismo huésped (normalmente una cepa de laboratorio de E. coli , benigna y de fácil cultivo ). Esto genera una población de organismos en los que las moléculas de ADN recombinante se replican junto con el ADN del huésped. Debido a que contienen fragmentos de ADN extraño, se denominan microorganismos transgénicos o modificados genéticamente ( OGM ). [ 3 ] Este proceso aprovecha el hecho de que una sola célula bacteriana puede ser inducida a incorporar y replicar una sola molécula de ADN recombinante. Esta célula individual puede expandirse exponencialmente para generar un gran número de bacterias, cada una de las cuales contiene copias de la molécula recombinante original. Por lo tanto, tanto la población bacteriana resultante como la molécula de ADN recombinante se denominan comúnmente "clones". Estrictamente hablando, el ADN recombinante se refiere a las moléculas de ADN, mientras que la clonación molecular se refiere a los métodos experimentales utilizados para ensamblarlas. Surgió la idea de que se podrían insertar diferentes secuencias de ADN en un plásmido y que estas secuencias extrañas serían transportadas a las bacterias y replicadas como parte del plásmido. Es decir, estos plásmidos podrían servir como vectores de clonación para transportar genes. [ 4 ]

Prácticamente cualquier secuencia de ADN puede clonarse y amplificarse, pero existen algunos factores que pueden limitar el éxito del proceso. Ejemplos de secuencias de ADN difíciles de clonar son las repeticiones invertidas, los orígenes de replicación, los centrómeros y los telómeros. También hay una menor probabilidad de éxito al insertar secuencias de ADN de gran tamaño. Las inserciones mayores de 10 kbp tienen un éxito muy limitado, pero los bacteriófagos, como el bacteriófago λ, pueden modificarse para insertar con éxito una secuencia de hasta 40 kbp. [ 5 ]

Historia

Antes de la década de 1970, la comprensión de la genética y la biología molecular se veía gravemente obstaculizada por la incapacidad de aislar y estudiar genes individuales de organismos complejos. Esto cambió drásticamente con la llegada de los métodos de clonación molecular. Los microbiólogos, buscando comprender los mecanismos moleculares mediante los cuales las bacterias restringían el crecimiento de los bacteriófagos, aislaron endonucleasas de restricción , enzimas que podían cortar moléculas de ADN solo cuando se encontraban con secuencias de ADN específicas. [ 6 ] Demostraron que las enzimas de restricción cortaban moléculas de ADN de longitud cromosómica en ubicaciones específicas, y que secciones específicas de la molécula más grande podían purificarse mediante fraccionamiento por tamaño. Utilizando una segunda enzima, la ADN ligasa , los fragmentos generados por las enzimas de restricción podían unirse en nuevas combinaciones, denominadas ADN recombinante . Al recombinar segmentos de ADN de interés con ADN vector, como bacteriófagos o plásmidos, que se replican naturalmente dentro de las bacterias, se podían producir grandes cantidades de moléculas de ADN recombinante purificadas en cultivos bacterianos. Las primeras moléculas de ADN recombinante se generaron y estudiaron en 1972. [ 7 ] [ 8 ]

Descripción general

La clonación molecular aprovecha el hecho de que la estructura química del ADN es fundamentalmente la misma en todos los organismos vivos. Por lo tanto, si se inserta un segmento de ADN de cualquier organismo en un segmento de ADN que contiene las secuencias moleculares necesarias para la replicación del ADN , y el ADN recombinante resultante se introduce en el organismo del que se obtuvieron las secuencias de replicación, entonces el ADN extraño se replicará junto con el ADN de la célula huésped en el organismo transgénico .

La clonación molecular es similar a la PCR en que permite la replicación de secuencias de ADN. La diferencia fundamental entre ambos métodos radica en que la clonación molecular implica la replicación del ADN en un microorganismo vivo, mientras que la PCR replica el ADN en una solución in vitro , libre de células vivas.

Clonación y simulaciones in silico

Antes de realizar los experimentos de clonación en el laboratorio, la mayoría se planifican en un ordenador utilizando software especializado. Aunque la planificación detallada de la clonación puede realizarse en cualquier editor de texto, junto con utilidades en línea como el diseño de cebadores de PCR, existen programas informáticos específicos para este fin. Algunos ejemplos de software para este propósito son ApE.(código abierto), DNAStrider(código abierto), Clonador serial(gratis), Colágeno(código abierto) y SnapGene (comercial). Estos programas permiten simular reacciones de PCR , digestiones con enzimas de restricción , ligaciones , etc., es decir, todos los pasos que se describen a continuación.

Pasos

El objetivo general de la clonación molecular es tomar un gen de interés de un plásmido e insertarlo en otro plásmido. [ 9 ] Esto se logra mediante PCR, reacción de digestión, reacción de ligación y transformación.

En los experimentos estándar de clonación molecular, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos: (1) Elección del organismo huésped y del vector de clonación, (2) Preparación del ADN del vector, (3) Preparación del ADN que se va a clonar, (4) Creación de ADN recombinante, (5) Introducción del ADN recombinante en el organismo huésped, (6) Selección de organismos que contienen ADN recombinante, (7) Cribado de clones con inserciones de ADN y propiedades biológicas deseadas.

Cabe destacar que la creciente capacidad y fidelidad de las plataformas de síntesis de ADN permiten diseños cada vez más complejos en ingeniería molecular. Estos proyectos pueden incluir cadenas muy largas de secuencias de ADN novedosas y/o probar bibliotecas completas simultáneamente, en lugar de secuencias individuales. Estos cambios introducen una complejidad que requiere que el diseño se aleje de la representación plana basada en nucleótidos y se dirija hacia un nivel de abstracción superior. Ejemplos de estas herramientas son GenoCAD y Teselagen.(gratis para el ámbito académico) o GeneticConstructor(Gratis para académicos).

Elección del organismo huésped y del vector de clonación.

Diagrama de un plásmido de clonación de uso común: pBR322 . Se trata de una molécula circular de ADN de 4361 bases de longitud. Contiene dos genes de resistencia a antibióticos , que confieren resistencia a la ampicilina y la tetraciclina , y un origen de replicación que el huésped utiliza para replicar el ADN.

Aunque se utiliza una gran cantidad de organismos huéspedes y vectores de clonación molecular, la gran mayoría de los experimentos de clonación molecular comienzan con una cepa de laboratorio de la bacteria E. coli ( Escherichia coli ) y un vector de clonación plasmídico . E. coli y los vectores plasmídicos se utilizan comúnmente porque son técnicamente sofisticados, versátiles, están ampliamente disponibles y ofrecen un rápido crecimiento de organismos recombinantes con un equipo mínimo. [ 3 ] Si el ADN que se va a clonar es excepcionalmente grande (cientos de miles a millones de pares de bases), entonces se suele elegir un cromosoma artificial bacteriano [ 10 ] o un vector de cromosoma artificial de levadura .

Las aplicaciones especializadas pueden requerir sistemas huésped-vector especializados. Por ejemplo, si los experimentadores desean obtener una proteína específica del organismo recombinante, se elige un vector de expresión que contenga las señales adecuadas para la transcripción y la traducción en el organismo huésped deseado. Alternativamente, si se desea replicar el ADN en diferentes especies (por ejemplo, transferir ADN de bacterias a plantas), se puede seleccionar un vector de amplio rango de huéspedes (también denominado vector lanzadera ). Sin embargo, en la práctica, los experimentos especializados de clonación molecular suelen comenzar con la clonación en un plásmido bacteriano, seguida de la subclonación en un vector especializado.

Cualquier combinación de huésped y vector que se utilice, el vector casi siempre contiene cuatro segmentos de ADN que son de vital importancia para su función y utilidad experimental: [ 3 ]

  • El origen de replicación del ADN es necesario para que el vector (y sus secuencias recombinantes asociadas) se repliquen dentro del organismo huésped.
  • uno o más sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción únicos que sirven como sitios donde se puede introducir ADN extraño
  • un gen marcador genético seleccionable que puede utilizarse para permitir la supervivencia de las células que han incorporado secuencias vectoriales.
  • un gen marcador que puede utilizarse para detectar células que contienen ADN extraño
Escisión de una secuencia de ADN que contiene el sitio de restricción BamHI . El ADN se escinde en la secuencia palindrómica para producir "extremos cohesivos".

Preparación del ADN del vector

El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para cortar el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño. La enzima de restricción se elige para generar una configuración en el sitio de corte que sea compatible con los extremos del ADN extraño (véase extremo del ADN ). Normalmente, esto se hace cortando el ADN del vector y el ADN extraño con la misma enzima de restricción o endonucleasa de restricción, por ejemplo EcoRI , y esta enzima de restricción se aisló de E. coli. [ 11 ] La mayoría de los vectores modernos contienen una variedad de sitios de corte convenientes que son únicos dentro de la molécula del vector (de modo que el vector solo puede cortarse en un único sitio) y están ubicados dentro de un gen (frecuentemente beta-galactosidasa ) cuya inactivación puede usarse para distinguir organismos recombinantes de no recombinantes en una etapa posterior del proceso. Para mejorar la proporción de organismos recombinantes a no recombinantes, el vector cortado puede tratarse con una enzima ( fosfatasa alcalina ) que desfosforila los extremos del vector. Las moléculas de vector con extremos desfosforilados no pueden replicarse, y la replicación solo puede restablecerse si se integra ADN extraño en el sitio de escisión. [ 12 ]

Preparación del ADN que se va a clonar

El ADN para clonación se produce con mayor frecuencia mediante PCR . El ADN molde se mezcla con bases (los componentes básicos del ADN), cebadores (fragmentos cortos de ADN monocatenario complementario) y una enzima ADN polimerasa que sintetiza la cadena de ADN. La mezcla se somete a ciclos de calentamiento y enfriamiento para producir grandes cantidades de ADN clonado.

Para la clonación de ADN genómico, el ADN que se va a clonar se extrae del organismo de interés. Prácticamente cualquier tejido puede utilizarse (incluso tejidos de animales extintos ), [ 13 ] siempre que el ADN no esté muy degradado. A continuación, el ADN se purifica mediante métodos sencillos para eliminar proteínas contaminantes (extracción con fenol), ARN (ribonucleasa) y moléculas más pequeñas (precipitación y/o cromatografía). Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan a menudo para la amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN ( RT-PCR ) antes de la clonación molecular.

El ADN para experimentos de clonación también puede obtenerse a partir de ARN mediante transcriptasa inversa ( clonación de ADN complementario o cDNA), o en forma de ADN sintético ( síntesis de genes artificiales ). La clonación de cDNA se utiliza habitualmente para obtener clones representativos de la población de ARNm de las células de interés, mientras que el ADN sintético se utiliza para obtener cualquier secuencia precisa definida por el diseñador. Dicha secuencia diseñada puede ser necesaria al trasladar genes a través de códigos genéticos (por ejemplo, de las mitocondrias al núcleo) [ 14 ] o simplemente para aumentar la expresión mediante la optimización de codones [ 15 ] .

El ADN purificado se trata posteriormente con una enzima de restricción para generar fragmentos con extremos que puedan unirse a los del vector. Si es necesario, se pueden añadir segmentos cortos de ADN de doble cadena ( enlazadores ) que contengan los sitios de restricción deseados para crear estructuras terminales compatibles con el vector. [ 3 ] [ 12 ]

Creación de ADN recombinante con ADN ligasa

La creación de ADN recombinante es, en muchos sentidos, el paso más sencillo del proceso de clonación molecular. El ADN preparado a partir del vector y de la fuente externa se mezcla simplemente en las concentraciones adecuadas y se expone a una enzima ( ADN ligasa ) que une covalentemente los extremos. Esta reacción de unión se denomina ligación . La mezcla de ADN resultante, con extremos unidos aleatoriamente, está lista para ser introducida en el organismo huésped.

La ADN ligasa solo reconoce y actúa sobre los extremos de las moléculas de ADN lineal, lo que generalmente resulta en una mezcla compleja de moléculas de ADN con extremos unidos aleatoriamente. Los productos deseados (ADN del vector unido covalentemente al ADN extraño) estarán presentes, pero también suelen estar presentes otras secuencias (por ejemplo, ADN extraño unido a sí mismo, ADN del vector unido a sí mismo y combinaciones de orden superior de ADN del vector y ADN extraño). Esta mezcla compleja se separa en las etapas posteriores del proceso de clonación, después de que la mezcla de ADN se introduce en las células. [ 3 ] [ 12 ]

Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped.

La mezcla de ADN, previamente manipulada in vitro, se reintroduce en una célula viva, denominada organismo huésped. Los métodos utilizados para introducir ADN en las células son variados, y el nombre que se le da a este paso en el proceso de clonación molecular suele depender del método experimental elegido (por ejemplo, transformación , transducción , transfección , electroporación ). [ 3 ] [ 12 ]

Cuando los microorganismos son capaces de captar y replicar ADN de su entorno local, el proceso se denomina transformación , y las células que se encuentran en un estado fisiológico que les permite captar ADN se denominan competentes . [ 16 ] En el cultivo de células de mamíferos, el proceso análogo de introducción de ADN en las células se denomina comúnmente transfección . Tanto la transformación como la transfección suelen requerir la preparación de las células mediante un régimen de crecimiento especial y un proceso de tratamiento químico que variará según la especie y el tipo de célula específicos que se utilicen.

La electroporación utiliza pulsos eléctricos de alto voltaje para transportar ADN a través de la membrana celular (y la pared celular, si está presente). [ 17 ] En cambio, la transducción implica el empaquetamiento del ADN en partículas derivadas de virus y el uso de estas partículas para introducir el ADN encapsulado en la célula mediante un proceso similar a la infección viral. Si bien la electroporación y la transducción son métodos altamente especializados, podrían ser los más eficientes para introducir ADN en las células.

Selección de organismos que contienen secuencias vectoriales

Independientemente del método utilizado, la introducción de ADN recombinante en el organismo huésped elegido suele ser un proceso de baja eficiencia; es decir, solo una pequeña fracción de las células incorporará el ADN. Los científicos experimentales abordan este problema mediante una etapa de selección genética artificial, en la que se eliminan selectivamente las células que no han incorporado el ADN, y solo sobreviven aquellas que pueden replicar activamente el ADN que contiene el gen marcador seleccionable codificado por el vector. [ 3 ] [ 12 ]

Cuando se utilizan células bacterianas como organismos huéspedes, el marcador seleccionable suele ser un gen que confiere resistencia a un antibiótico que, de otro modo, mataría a las células, normalmente la ampicilina . Las células que contienen el plásmido sobrevivirán al exponerse al antibiótico, mientras que aquellas que no hayan incorporado las secuencias del plásmido morirán. Cuando se utilizan células de mamíferos (por ejemplo, células humanas o de ratón), se emplea una estrategia similar, con la diferencia de que el gen marcador (en este caso, normalmente codificado como parte del casete kanMX ) confiere resistencia al antibiótico Geneticina .

Selección de clones con inserciones de ADN y propiedades biológicas deseadas.

Los vectores de clonación bacteriana modernos (por ejemplo, pUC19 y sus derivados posteriores, incluidos los vectores pGEM) utilizan el sistema de cribado azul-blanco para distinguir las colonias (clones) de células transgénicas de aquellas que contienen el vector parental (es decir, ADN del vector sin secuencia recombinante insertada). En estos vectores, el ADN extraño se inserta en una secuencia que codifica una parte esencial de la beta-galactosidasa , una enzima cuya actividad produce la formación de una colonia azul en el medio de cultivo utilizado para este trabajo. La inserción del ADN extraño en la secuencia codificante de la beta-galactosidasa inactiva la función de la enzima, de modo que las colonias que contienen ADN transformado permanecen incoloras (blancas). Por lo tanto, los experimentadores pueden identificar fácilmente los clones bacterianos transgénicos y realizar estudios posteriores sobre ellos, ignorando aquellos que no contienen ADN recombinante.

La población total de clones individuales obtenidos en un experimento de clonación molecular se denomina a menudo biblioteca de ADN . Las bibliotecas pueden ser muy complejas (como cuando se clona el ADN genómico completo de un organismo) o relativamente simples (como cuando se transfiere un fragmento de ADN previamente clonado a un plásmido diferente), pero casi siempre es necesario examinar varios clones diferentes para asegurar que se obtiene la construcción de ADN deseada. Esto se puede lograr mediante una amplia gama de métodos experimentales, incluyendo el uso de hibridaciones de ácidos nucleicos , sondas de anticuerpos , reacción en cadena de la polimerasa , análisis de fragmentos de restricción y/o secuenciación de ADN . [ 3 ] [ 12 ]

Aplicaciones

La clonación molecular proporciona a los científicos una cantidad prácticamente ilimitada de segmentos de ADN individuales derivados de cualquier genoma. Este material puede utilizarse para una amplia gama de propósitos, tanto en la biología básica como en la aplicada. A continuación, se resumen algunas de las aplicaciones más importantes.

Organización del genoma y expresión génica

La clonación molecular ha permitido dilucidar directamente la secuencia completa de ADN de los genomas de un gran número de especies y explorar la diversidad genética dentro de cada especie. Este trabajo se ha realizado principalmente determinando la secuencia de ADN de un gran número de fragmentos del genoma clonados aleatoriamente y ensamblando las secuencias superpuestas.

A nivel de genes individuales, los clones moleculares se utilizan para generar sondas que permiten examinar la expresión génica y su relación con otros procesos biológicos, como el entorno metabólico, las señales extracelulares, el desarrollo, el aprendizaje, la senescencia y la muerte celular. Los genes clonados también proporcionan herramientas para analizar la función e importancia biológica de genes individuales, permitiendo a los investigadores inactivarlos o realizar mutaciones más sutiles mediante mutagénesis regional o mutagénesis dirigida . Los genes clonados en vectores de expresión para clonación funcional ofrecen un método para seleccionar genes en función de la función de la proteína expresada.

Producción de proteínas recombinantes

La obtención del clon molecular de un gen puede conducir al desarrollo de organismos que producen la proteína resultante, denominada proteína recombinante. En la práctica, suele ser más difícil desarrollar un organismo que produzca una forma activa de la proteína recombinante en las cantidades deseadas que clonar el gen. Esto se debe a que las señales moleculares para la expresión génica son complejas y variables, y a que el plegamiento, la estabilidad y el transporte de las proteínas pueden resultar muy complicados.

Muchas proteínas útiles están disponibles actualmente como productos recombinantes . Estos incluyen: (1) proteínas médicamente útiles cuya administración puede corregir un gen defectuoso o mal expresado (por ejemplo, factor VIII recombinante , un factor de coagulación sanguínea deficiente en algunas formas de hemofilia , [ 18 ] e insulina recombinante , utilizada para tratar algunas formas de diabetes [ 19 ] ), (2) proteínas que pueden administrarse para ayudar en una emergencia potencialmente mortal (por ejemplo, activador tisular del plasminógeno , utilizado para tratar accidentes cerebrovasculares [ 20 ] ), (3) vacunas de subunidades recombinantes, en las que una proteína purificada puede utilizarse para inmunizar a los pacientes contra enfermedades infecciosas, sin exponerlos al agente infeccioso en sí (por ejemplo, vacuna contra la hepatitis B [ 21 ] ), y (4) proteínas recombinantes como material estándar para pruebas de laboratorio de diagnóstico.

organismos transgénicos

Una vez caracterizados y manipulados para proporcionar señales para la expresión adecuada, los genes clonados pueden insertarse en organismos, generando organismos transgénicos, también denominados organismos genéticamente modificados (OGM). Aunque la mayoría de los OGM se generan con fines de investigación biológica básica (véase, por ejemplo, el ratón transgénico ), se han desarrollado varios OGM para uso comercial, que van desde animales y plantas que producen productos farmacéuticos u otros compuestos ( farmacia ), plantas de cultivo resistentes a herbicidas y peces tropicales fluorescentes ( GloFish ) para el entretenimiento doméstico. [ 1 ]

terapia génica

La terapia génica consiste en suministrar un gen funcional a células que carecen de esa función, con el objetivo de corregir un trastorno genético o una enfermedad adquirida. La terapia génica se puede dividir en dos categorías principales. La primera es la alteración de las células germinales, es decir, los espermatozoides u óvulos, lo que produce un cambio genético permanente en todo el organismo y las generaciones posteriores. Esta "terapia génica de la línea germinal" es considerada por muchos como poco ética en seres humanos. [ 22 ] El segundo tipo de terapia génica, la "terapia génica de células somáticas", es análoga a un trasplante de órganos. En este caso, se trata uno o más tejidos específicos mediante tratamiento directo o mediante la extirpación del tejido, la adición del gen o genes terapéuticos en el laboratorio y la posterior reintroducción de las células tratadas en el paciente. Los ensayos clínicos de terapia génica de células somáticas comenzaron a finales de la década de 1990, principalmente para el tratamiento de cánceres y trastornos de la sangre, el hígado y los pulmones. [ 23 ]

A pesar de la gran publicidad y las promesas, la historia de la terapia génica humana se ha caracterizado por un éxito relativamente limitado. [ 23 ] El efecto de introducir un gen en las células a menudo promueve solo un alivio parcial y/o transitorio de los síntomas de la enfermedad tratada. Algunos pacientes de ensayos de terapia génica han sufrido consecuencias adversas del propio tratamiento, incluyendo la muerte. En algunos casos, los efectos adversos resultan de la interrupción de genes esenciales dentro del genoma del paciente por inactivación por inserción. En otros, los vectores virales utilizados para la terapia génica se han contaminado con virus infecciosos. No obstante, la terapia génica sigue considerándose un área prometedora de la medicina y es un área donde existe un nivel significativo de actividad de investigación y desarrollo.

Véase también

Referencias

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  2. ↑ Patten CL, Glick BR, Pasternak J (2009). Biotecnología molecular: Principios y aplicaciones del ADN recombinante . Washington, DC: ASM Press. ISBN 978-1-55581-498-4.
  3. 1 2 3 4 5 6 7 8 Brown T (2006). Clonación de genes y análisis de ADN: una introducción . Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 978-1-4051-1121-8.
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  5. ↑ Garrett RH, Grisham CM (2010). Bioquímica (Cuarta ed.). Belmont, CA, Brooks/Cole: Cengage Learning. pág. 380. ISBN   978-0-495-10935-8OCLC 297392560​​ 
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Lecturas adicionales

  • Matsumura I (septiembre de 2015). «Por qué Johnny no puede clonar: errores comunes y soluciones no tan comunes» . BioTechniques . 59 (3): IV– XIII. doi : 10.2144/000114324 . PMID 26345511. Archivado del original el 16 de septiembre de 2015. Consultado el 2 de febrero de 2016 . 
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