Secuenciación en tiempo real de molécula única

Para preparar la biblioteca, los fragmentos de ADN se colocan en forma circular utilizando ligaciones de adaptadores en horquilla. ^{[ 3 ]}

Para cada una de las bases nucleotídicas, existe una molécula de colorante fluorescente correspondiente que permite al detector identificar la base que la ADN polimerasa incorpora durante la síntesis de ADN . La molécula de colorante fluorescente está unida a la cadena de fosfato del nucleótido. Cuando la ADN polimerasa incorpora el nucleótido, el colorante fluorescente se separa de la cadena de fosfato como parte de un proceso natural de síntesis de ADN, durante el cual se crea un enlace fosfodiéster para alargar la cadena de ADN. La molécula de colorante fluorescente separada se difunde fuera del volumen de detección, por lo que la señal fluorescente deja de detectarse. ^{[ 4 ]}

La guía de onda de modo cero (ZMW) es una estructura de confinamiento nanofotónico que consiste en un orificio circular en una película de revestimiento de aluminio depositada sobre un sustrato de sílice transparente. ^{[ 5 ]}

Los orificios ZMW tienen  un diámetro de aproximadamente 70 nm y  una profundidad de aproximadamente 100 nm. Debido al comportamiento de la luz al viajar a través de una pequeña abertura, el campo óptico decae exponencialmente dentro de la cámara. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

El volumen de observación dentro de un ZMW iluminado es de aproximadamente 20 zeptolitros (20 × 10⁻²¹ ^litros ). Este volumen tan reducido elimina la fluorescencia de fondo de los nucleótidos fluorescentes libres no incorporados presentes en la solución. Dentro de este volumen, se puede detectar fácilmente la actividad de la ADN polimerasa que incorpora un solo nucleótido, donde cada nucleótido tiene un color distinto. ^{[ 4 ] [ 8 ]}

En el momento de su comercialización, la longitud de lectura presentaba una distribución normal con una media de aproximadamente 1100 bases. Un nuevo kit químico lanzado a principios de 2012 aumentó la longitud de lectura del secuenciador; un cliente inicial de dicho kit mencionó longitudes de lectura medias de entre 2500 y 2900 bases. ^{[ 13 ]}

El kit de química XL lanzado a finales de 2012 aumentó la longitud de lectura promedio a más de 4300 bases. ^{[ 14 ] [ 15 ]}

El 21 de agosto de 2013, PacBio lanzó un nuevo kit de unión de ADN polimerasa P4. Esta enzima P4 tiene longitudes de lectura promedio de más de 4300 bases cuando se combina con la química de secuenciación C2 y más de 5000 bases cuando se combina con la química XL. ^{[ 16 ]} La precisión de la enzima es similar a la de C2, alcanzando QV50 entre 30X y 40X de cobertura. Los atributos resultantes de P4 proporcionaron ensamblajes de mayor calidad utilizando menos celdas SMRT y con una llamada de variantes mejorada. ^{[ 16 ]} Cuando se combina con la selección del tamaño del ADN de entrada (utilizando un instrumento de electroforesis como BluePippin) produce una longitud de lectura promedio de más de 7 kilobases. ^{[ 17 ]}

El 3 de octubre de 2013, PacBio lanzó una nueva combinación de reactivos para PacBio RS II, la ADN polimerasa P5 con química C3 (P5-C3). Juntos, extienden la longitud de lectura de secuenciación a un promedio de aproximadamente 8500 bases, con lecturas más largas que superan las 30 000 bases. ^{[ 18 ]} El rendimiento por célula SMRT es de alrededor de 500 millones de bases, demostrado por los resultados de secuenciación de la línea celular CHM1. ^{[ 19 ]}

El 15 de octubre de 2014, PacBio anunció el lanzamiento de la nueva química P6-C4 para el sistema RS II, que representa la sexta generación de polimerasa y la cuarta generación de química de la compañía, extendiendo aún más la longitud promedio de lectura a 10 000 - 15 000 bases, con lecturas más largas que superan las 40 000 bases. El rendimiento con la nueva química se estimó entre 500 millones y 1000 millones de bases por celda SMRT, dependiendo de la muestra que se esté secuenciando. ^{[ 20 ] [ 21 ]} Esta fue la versión final de la química lanzada para el instrumento RS.

El rendimiento por experimento de esta tecnología está influenciado tanto por la longitud de lectura de las moléculas de ADN secuenciadas como por la multiplexación total de una celda SMRT. El prototipo de la celda SMRT contenía aproximadamente 3000 orificios ZMW que permitían la secuenciación paralela de ADN. En su comercialización, cada celda SMRT se diseñó con 150 000 orificios ZMW que se leían en dos conjuntos de 75 000. ^{[ 22 ]} En abril de 2013, la empresa lanzó una nueva versión del secuenciador llamada "PacBio RS II" que utiliza los 150 000 orificios ZMW simultáneamente, duplicando el rendimiento por experimento. ^{[ 23 ] [ 24 ]} El modo de mayor rendimiento en noviembre de 2013 utilizó la unión P5, la química C3, la selección de tamaño BluePippin y un PacBio RS II que oficialmente produjo 350 millones de bases por SMRT Cell, aunque un conjunto de datos humanos de novo publicado con la química promedió 500 millones de bases por SMRT Cell. El rendimiento varía según el tipo de muestra que se esté secuenciando. ^{[ 25 ]} Con la introducción de la química P6-C4, el rendimiento típico por SMRT Cell aumentó de 500 millones de bases a 1000 millones de bases.

En septiembre de 2015, la empresa anunció el lanzamiento de un nuevo instrumento de secuenciación, el Sistema Sequel, que aumentó la capacidad a 1 millón de agujeros ZMW. ^{[ 26 ] [ 27 ]}

Con el instrumento Sequel, las longitudes de lectura iniciales eran comparables a las del RS, pero las versiones químicas posteriores aumentaron la longitud de lectura.

El 23 de enero de 2017 se lanzó la química V2. Esta aumentó la longitud promedio de lectura a entre 10.000 y 18.000 bases. ^{[ 28 ]}

El 8 de marzo de 2018 se lanzó la versión 2.1 de la química. Esta versión aumentó la longitud media de lectura a 20 000 bases y la mitad de todas las lecturas superaron las 30 000 bases. El rendimiento por celda SMRT aumentó a 10 000 o 20 000 millones de bases, respectivamente, para bibliotecas con inserciones grandes o bibliotecas con inserciones más cortas (por ejemplo, amplicones ). ^{[ 29 ]}

El 19 de septiembre de 2018, la compañía anunció la química Sequel 6.0 con longitudes de lectura promedio aumentadas a 100 000 bases para bibliotecas de inserción más cortas y 30 000 para bibliotecas de inserción más largas. El rendimiento de SMRT Cell aumentó hasta 50 000 millones de bases para bibliotecas de inserción más cortas. ^{[ 10 ]}

En abril de 2019, la empresa lanzó una nueva celda SMRT con ocho millones de ZMW, ^{[ 30 ]} aumentando el rendimiento esperado por celda SMRT en un factor de ocho. ^{[ 31 ]} Los clientes de acceso anticipado en marzo de 2019 informaron un rendimiento sobre 58 celdas ejecutadas por el cliente de 250 GB de rendimiento bruto por celda con plantillas de aproximadamente 15 kb de longitud, y un rendimiento de 67,4 GB por celda con plantillas en moléculas de mayor peso. ^{[ 32 ]} El rendimiento del sistema ahora se informa en lecturas largas continuas de alto peso molecular o en lecturas HiFi pre-corregidas (también conocidas como secuencia de consenso circular (CCS)). Para lecturas de alto peso molecular, aproximadamente la mitad de todas las lecturas son más largas que 50 kb de longitud.

El rendimiento HiFi incluye bases corregidas con una calidad superior a la puntuación Phred Q20, mediante pasadas repetidas del amplificador para su corrección. Esto permite procesar amplificadores de hasta 20 kb de longitud.