Inactivación del virus

La inactivación viral consiste en impedir que los virus de una muestra determinada contaminen el producto deseado, ya sea eliminándolos por completo o volviéndolos no infecciosos. Estas técnicas se utilizan ampliamente en las industrias de alimentos y plasma sanguíneo ^[1] , ya que esos productos pueden resultar dañados por la presencia de partículas virales. Algunos de los virus más comunes eliminados mediante estos métodos son los virus VIH-1 y VIH-2 ; los virus de la hepatitis A, B y C; y los parvovirus ^[2] . Estos métodos se han adaptado para eliminar los priones , que no están relacionados con los virus, de los productos sanguíneos ^{[3] .}

Este proceso general, que se conoce simplemente como eliminación de virus, consiste en eliminar todos los virus de una muestra determinada mediante métodos de extracción tradicionales o de [energía completa]. Algunos de los métodos más destacados son:

• Nanofiltración
• Cromatografía

Estos procesos de extracción se consideran “procesos tradicionales” porque no afectan químicamente al virus de ninguna manera; simplemente lo eliminan físicamente de la muestra.

Los procesos de eliminación de virus mediante técnicas de nanofiltración ^[4] eliminan los virus específicamente por exclusión de tamaño. Este tipo de proceso se utiliza normalmente para parvovirus ^[5] y otros virus que contienen una capa de proteína . Un virión de VIH típico tiene 180 nm y un parvovirus típico puede variar entre 15 y 24 nm, lo cual es muy pequeño. Una gran ventaja de la filtración, a diferencia de los métodos que implican extremos de temperatura o acidez, es que la filtración no desnaturalizará las proteínas de la muestra. La nanofiltración también es eficaz para la mayoría de los tipos de proteínas. Dado que no es químicamente selectiva, sin importar cuál sea la química de la superficie de la partícula viral, los procesos de eliminación viral mediante técnicas de nanofiltración seguirán siendo eficaces. Otra gran ventaja de esta técnica es su capacidad para realizarse a escala de laboratorio y luego ampliarse de manera efectiva a los estándares de producción. Sin embargo, es importante considerar el hecho de que el nivel de eliminación de los virus depende del tamaño de los poros del nanofiltro. En algunos casos, los virus muy pequeños no se filtrarán. También es necesario considerar los posibles efectos de la variación de presión y caudal.

Algunos de los filtros utilizados para realizar este tipo de procesos son Planova 15N, ^[6] Planova 20N, BioEX, VAG – 300, Viresolve 180, ^[7] Viresolve 70TM, y la gama Virosart ^{[8] .}

Los métodos cromatográficos para eliminar virus son excelentes para purificar la proteína y también son eficaces contra todo tipo de virus, pero el nivel de eliminación de virus depende de la composición de la columna y de los reactivos que se utilizan en el proceso. La eficacia de este proceso puede variar mucho entre virus y su eficiencia puede cambiar en función del tampón utilizado. La desinfección entre lotes también es una preocupación al realizar este procedimiento.

La cromatografía de membrana es cada vez más popular para la purificación y eliminación de virus.

La inactivación viral hace que los virus sean incapaces de infectar. Muchos virus contienen capas de lípidos o proteínas que pueden inactivarse mediante una alteración química. La inactivación viral es diferente de la eliminación viral porque, en el primer proceso, se altera la química de la superficie del virus y, en muchos casos, las partículas virales (ahora no infecciosas) permanecen en el producto final. En lugar de simplemente inactivar el virus, algunos procesos de inactivación viral en realidad lo desnaturalizan por completo. La inactivación viral se utiliza ampliamente en la industria del plasma sanguíneo y en la fabricación de productos biofarmacéuticos basados ​​en anticuerpos monoclonales .

Para lograr la inactivación de los virus presentes en la muestra, es necesario realizar procesos de purificación “especiales” que alteren químicamente el virus de alguna manera. Algunos de los procesos más utilizados son los siguientes:

• Inactivación de disolventes/detergentes
• Pasteurización (calentamiento)
• Inactivación por pH ácido

En algunos casos, la inactivación viral no es una alternativa de eliminación viable porque incluso las partículas virales desnaturalizadas o inactivadas de otro modo pueden tener efectos nocivos en el flujo del proceso o en el producto mismo.

Este proceso, desarrollado por el New York Blood Center , ^[9] es el método de inactivación viral más utilizado hasta la fecha. Se utiliza predominantemente en la industria del plasma sanguíneo, por más de 50 organizaciones en todo el mundo y por la Cruz Roja Americana [1]. Sin embargo, este proceso solo es eficaz para los virus envueltos en una capa lipídica . Los detergentes utilizados en este método interrumpen las interacciones entre las moléculas en la capa lipídica del virus. La mayoría de los virus envueltos no pueden existir sin su capa lipídica, por lo que se destruyen cuando se exponen a estos detergentes. Es posible que otros virus no se destruyan, pero no pueden reproducirse, lo que los vuelve no infecciosos. El disolvente crea un entorno en el que la reacción de agregación entre la capa lipídica y el detergente ocurre más rápidamente. El detergente que se utiliza normalmente es Triton X-100 .

Este proceso tiene muchas de las ventajas de las técnicas de eliminación "tradicionales". Este proceso no desnaturaliza las proteínas, porque los detergentes solo afectan a los lípidos y a los derivados de los lípidos. Se logra una muerte viral del 100 % con este proceso y el equipo es relativamente simple y fácil de usar. Sería necesario un equipo diseñado para purificar el material inactivado por el virus para evitar la contaminación de los flujos de proceso posteriores.

El tratamiento S/D utiliza reactivos disponibles y relativamente económicos, pero estos reactivos deben eliminarse del producto antes de su distribución, lo que requeriría pasos de proceso adicionales. Debido a que este proceso elimina/inactiva la capa lipídica de un virus, los virus sin ningún tipo de envoltura lipídica no se verán afectados. Los tampones utilizados en este proceso tampoco tienen ningún efecto de inactivación.

La inactivación de virus mediante pasteurización puede ser muy eficaz si las proteínas que se intentan proteger son más resistentes al calor que las impurezas virales con las que se encuentran en solución. Algunas de las ventajas más destacadas de este tipo de procesos son que requieren un equipo sencillo y son eficaces tanto para virus envueltos como no envueltos. Dado que la pasteurización implica aumentar la temperatura de la solución a un valor que desnaturalice suficientemente el virus, no importa si el virus tiene envoltura o no, ya que la envoltura por sí sola no puede proteger al virus de temperaturas tan altas. Sin embargo, se ha descubierto que algunas proteínas actúan como estabilizadores térmicos de los virus. Por supuesto, si la proteína objetivo no es resistente al calor, el uso de esta técnica podría desnaturalizar esa proteína objetivo así como la impureza viral. La incubación típica dura 10 horas y se realiza a 60 ° C .

Algunos virus, cuando se exponen a un pH bajo , se desnaturalizan espontáneamente. De manera similar a la pasteurización, esta técnica de inactivación viral es útil si la proteína objetivo es más resistente a pH bajos que la impureza viral. Esta técnica es eficaz contra virus envueltos y el equipo que se utiliza normalmente es simple y fácil de usar. Sin embargo, este tipo de método de inactivación no es tan eficaz para virus no envueltos y también requiere temperaturas elevadas. Por lo tanto, para utilizar este método, la proteína objetivo debe ser resistente a pH bajos y temperaturas altas, lo que lamentablemente no es el caso de muchas proteínas biológicas. La incubación para este proceso suele ocurrir a un pH de 4 y dura entre 6 horas y 21 días.

La inactivación ácida se utiliza habitualmente en el proceso de fabricación de productos biofarmacéuticos basados ​​en anticuerpos monoclonales . El proceso consiste en reducir el pH hasta cerca de 3,6 o por debajo de él y en incubarlo durante al menos treinta minutos a temperatura ambiente. ^[10]

Los rayos UV pueden dañar el ADN de los organismos vivos creando dímeros de ácidos nucleicos. Sin embargo, los daños no suelen ser importantes debido a la baja penetración de los rayos UV a través de los tejidos vivos. Sin embargo, los rayos UV pueden utilizarse para inactivar virus, ya que las partículas virales son pequeñas y los rayos UV pueden alcanzar el material genético, induciendo la dimerización de los ácidos nucleicos. Una vez que el ADN se dimeriza, las partículas virales no pueden replicar su material genético, lo que les impide propagarse.

Se ha demostrado que la luz ultravioleta en combinación con riboflavina es eficaz para reducir los patógenos en los productos de transfusión sanguínea. ^{[11] [12]} La riboflavina y la luz ultravioleta dañan los ácidos nucleicos de los virus, bacterias, parásitos y glóbulos blancos de los donantes, dejándolos incapaces de replicarse y causar enfermedades. ^{[13] [14] [15]}

En muchos casos, la concentración de virus en una muestra determinada es extremadamente baja. En otros procesos de extracción, los niveles bajos de impurezas pueden ser insignificantes, pero como los virus son impurezas infecciosas , una sola partícula viral puede ser suficiente para arruinar toda la cadena de procesos. Por este motivo, se deben tomar medidas especiales para determinar el método de eliminación o inactivación adecuado para cualquier tipo de virus que se extraiga de cualquier tipo de solución.

Los estudios de adición se crearon específicamente para este propósito. Un estudio de adición es un estudio que se realiza para determinar los posibles métodos de eliminación o inactivación viral. Los resultados de estos estudios son numéricos y, en función de estos números, los investigadores pueden determinar si el proceso en el que se realizó el estudio será adecuado o no para los virus que están tratando de extraer y la solución de la que están tratando de extraerlos.

Se ha demostrado mediante experimentos que aumentar el recuento viral (o nivel de actividad) de una muestra en un factor de 10 ⁴ o 10 ⁵ del original solo cambiará las proporciones de eliminación/inactivación del virus en un orden de magnitud [¿referencia?]. A partir de este conocimiento, se han creado estudios de adición en los que el número de virus (o nivel de activación) se aumenta o "se aumenta" en un factor de 10 ⁴ o 10 ⁵ de la muestra original. Este nuevo número o nivel de actividad alto se ejecuta a través del flujo de proceso y se purifica. El número o nivel de actividad se toma al principio y al final del flujo de proceso y se utiliza en el cálculo del factor de reducción.

El factor de reducción (RF) para un paso de eliminación o inactivación de virus se calcula utilizando la siguiente ecuación: ^[16]

_Paso de RF = logaritmo ₁₀ [(V1 x T1)/(V2 x T2)]

Dónde: V1 = volumen de materia prima enriquecida antes del paso de limpieza; T1 = concentración de virus de la materia prima enriquecida antes del paso de limpieza; V2 = volumen de material después del paso de limpieza; y T2 = concentración de virus del material después del paso de limpieza.

El factor de reducción necesario para un determinado flujo de proceso depende de muchos factores diferentes, algunos de los cuales incluyen:

• La concentración inicial esperada del virus
• El producto que se está purificando
• La dosis infecciosa del virus (para uso in vivo )
• Si la inactivación es una alternativa viable a la eliminación completa
• Las capacidades del laboratorio
• La relativa dificultad del método de inactivación o eliminación

Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en las industrias alimentaria y farmacéutica, pero algunas otras aplicaciones del procesamiento viral han sido:

• Purificación del aire (Millipore) ^[17]
• Vacunas
• Extracción de muestra viral
• Purificación de agua
• Inactivación del virus del Nilo Occidental