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perfusión mecánica

La perfusión mecánica (PM) es una técnica de perfusión artificial que se utiliza a menudo para la preservación de órganos y para facilitar el trasplante . La PM funciona bombean...

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La perfusión mecánica (PM) es una técnica de perfusión artificial que se utiliza a menudo para la preservación de órganos y para facilitar el trasplante . La PM funciona bombeando continuamente una solución especializada a través de los órganos del donante , imitando el flujo sanguíneo natural del cuerpo mientras controla activamente la temperatura , los niveles de oxígeno , la composición química y el estrés mecánico dentro del órgano. Al mantener la viabilidad del órgano fuera del cuerpo durante períodos prolongados, la perfusión mecánica aborda desafíos críticos en el trasplante de órganos, como los tiempos de preservación limitados [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] , e introduce una ventana de tiempo para la evaluación y reparación del injerto [ 4 ] .

La perfusión mecánica tiene varias formas y se puede clasificar según la temperatura del perfusado: frío (4  °C) y caliente (37  °C). [ 5 ] La perfusión mecánica se ha aplicado al trasplante renal , [ 6 ] al trasplante hepático [ 7 ] y al trasplante pulmonar . [ 8 ] Es una alternativa al almacenamiento en frío estático (SCS).

Investigación y desarrollo

En 2022 se informó de un récord de preservación de órganos humanos trasplantados mediante perfusión mecánica de un hígado durante 3 días, en lugar de las menos de 12 horas habituales. Podría extenderse a 10 días y prevenir daños celulares sustanciales mediante métodos de preservación a baja temperatura. [ 9 ] [ 10 ] Entre los enfoques alternativos se incluyen nuevos disolventes crioprotectores . [ 11 ] [ 12 ]

Existe un novedoso sistema de perfusión de órganos en desarrollo que puede restaurar, es decir, a nivel celular, múltiples órganos vitales (de cerdo) una hora después de la muerte (durante la cual el cuerpo sufrió una isquemia caliente prolongada ), [ 13 ] [ 14 ] y un método/sistema similar para revivir cerebros (de cerdo) horas después de la muerte. [ 13 ] [ 15 ] El sistema para la recuperación celular podría utilizarse para preservar órganos de donantes o para tratamientos de reanimación en emergencias médicas. [ 13 ]

Historia de las técnicas de preservación renal

Diagrama de perfusión regional normotérmica de órganos abdominales para su preparación para trasplante.

Un paso preliminar esencial para el desarrollo del almacenamiento y trasplante de riñón fue el trabajo de Alexis Carrel en el desarrollo de métodos para la anastomosis vascular . [ 16 ] Carrel describió los primeros trasplantes de riñón, que se realizaron en perros en 1902; Ullman [ 17 ] describió de forma independiente experimentos similares ese mismo año. En estos experimentos, los riñones se trasplantaron sin ningún intento de almacenamiento.

El paso crucial para hacer posible el almacenamiento in vitro de riñones fue la demostración de Fuhrman en 1943 [ 18 ] de un efecto reversible de la hipotermia en los procesos metabólicos de tejidos aislados. Antes de esto, los riñones se habían almacenado a temperaturas corporales normales utilizando sangre o perfusados ​​sanguíneos diluidos [ 19 ] [ 20 ] , pero no se habían realizado reimplantaciones exitosas. Fuhrman demostró que cortes de corteza renal y cerebro de rata  resistían el enfriamiento a 0,2 °C durante una hora, temperatura a la cual su consumo de oxígeno era mínimo. Cuando los cortes se recalentaban a 37  °C, su consumo de oxígeno volvía a la normalidad.

El efecto beneficioso de la hipotermia en riñones isquémicos intactos fue demostrado por Owens en 1955 [ 21 ] cuando mostró que, si los perros eran enfriados a 23-26  °C y sus aortas torácicas eran ocluidas durante 2 horas, sus riñones no mostraban daño aparente cuando los perros eran recalentados. Este efecto protector de la hipotermia sobre el daño isquémico renal fue confirmado por Bogardus [ 22 ] quien mostró un efecto protector del enfriamiento superficial de los riñones de perros cuyos pedículos renales fueron pinzados in situ durante 2 horas. Moyer [ 23 ] demostró la aplicabilidad de estos experimentos con perros a los humanos, al mostrar el mismo efecto en la función renal de perros y humanos con los mismos períodos de isquemia hipotérmica.

No fue hasta 1958 que se demostró que los riñones intactos de perro sobrevivirían a la isquemia incluso mejor si se enfriaban a temperaturas más bajas. Stueber [ 24 ] demostró que los riñones sobrevivirían al pinzamiento in situ del pedículo renal durante 6 horas si los riñones se enfriaban a 0-5  °C colocándolos en una camisa de enfriamiento, y Schloerb [ 25 ] demostró que una técnica similar con enfriamiento de riñones de perro heparinizados a 2-4  °C proporcionaba protección durante 8 horas pero no 12 horas. Schloerb también intentó el almacenamiento in vitro y el autotrasplante de riñones enfriados, y tuvo un superviviente a largo plazo después de 4 horas de almacenamiento del riñón seguido de reimplantación y nefrectomía contralateral inmediata . También tuvo un casi superviviente, después de 24 horas de almacenamiento del riñón y nefrectomía contralateral tardía, en un perro que desarrolló una trombosis arterial tardía en el riñón.

Estos métodos de enfriamiento superficial mejoraron con la introducción de técnicas en las que el sistema vascular del riñón se lavaba con líquido frío antes del almacenamiento. Esto tuvo el efecto de aumentar la velocidad de enfriamiento del riñón y eliminar los glóbulos rojos del sistema vascular. Kiser [ 26 ] utilizó esta técnica para lograr un almacenamiento in vitro exitoso de 7 horas de un riñón de perro, cuando el riñón se había lavado a 5  °C con una mezcla de dextrano y sangre diluida antes del almacenamiento. En 1960, Lapchinsky [ 27 ] confirmó que eran posibles períodos de almacenamiento similares, cuando informó que ocho perros sobrevivieron después de que sus riñones se almacenaran a 2-4  °C durante 28 horas, seguido de autotrasplante y nefrectomía contralateral tardía. Aunque Lapchinsky no dio detalles en su artículo, Humphries [ 28 ] informó que estos experimentos consistieron en enfriar los riñones durante 1 hora con sangre fría y luego almacenarlos a 2-4  °C, seguido de recalentarlos durante 1 hora con sangre caliente en el momento del reimplante. Las nefrectomías contralaterales se retrasaron dos meses.

Humphries [ 28 ] desarrolló esta técnica de almacenamiento mediante la perfusión continua del riñón durante todo el período de almacenamiento. Utilizó plasma o suero diluido como perfusado e indicó la necesidad de bajas presiones de perfusión para prevenir la inflamación renal, pero admitió que los valores óptimos para variables como la temperatura del perfusado, la Po₂ y el flujo, seguían siendo desconocidos. Sus mejores resultados, hasta el momento, fueron dos perros que sobrevivieron después de que sus riñones fueran almacenados durante 24 horas a 4-10  °C, seguidos de un autotrasplante y una nefrectomía contralateral diferida unas semanas después.

Calne [ 29 ] cuestionó la necesidad de utilizar métodos de perfusión continua al demostrar que se podía lograr una preservación exitosa de 12 horas utilizando técnicas mucho más sencillas. Calne logró que un riñón mantuviera la vida incluso cuando la nefrectomía contralateral se realizó al mismo tiempo que la operación de reimplantación. Calne simplemente heparinizó riñones de perro y luego los almacenó en una solución helada a 4  °C. Si bien se demostró que era posible una preservación de 17 horas en un experimento cuando se retrasó la nefrectomía, no se logró ningún éxito con el almacenamiento de 24 horas.

El siguiente avance lo realizó Humphries [ 30 ] en 1964, cuando modificó el perfusado utilizado en su sistema de perfusión continua original y logró que un riñón de perro pudiera mantener la vida después de 24 horas de almacenamiento, incluso cuando se realizó una nefrectomía contralateral inmediata al mismo tiempo que el reimplante. En estos experimentos se utilizó sangre autóloga, diluida al 50% con solución Tis-U-Sol a 10  °C, como perfusado. La presión del perfusado fue de 40  mm Hg y el pH del perfusado de 7,11-7,35 (a 37  °C). Se utilizó un pulmón de membrana para la oxigenación con el fin de evitar dañar la sangre.

En un intento por mejorar estos resultados, Manax [ 31 ] investigó el efecto del oxígeno hiperbárico y descubrió que era posible almacenar con éxito riñones de perro durante 48 horas a 2  °C sin perfusión continua, cuando los riñones se lavaban con una solución de dextrano /Tis-U-Sol antes del almacenamiento a una presión de 7,9 atmósferas, y si la nefrectomía contralateral se retrasaba hasta 2 a 4 semanas después del reimplante. Manax postuló que el oxígeno hiperbárico podría funcionar inhibiendo el metabolismo o facilitando la difusión de oxígeno en las células renales, pero no informó de experimentos de control para determinar si otros aspectos de su modelo eran más importantes que la hiperbaria.

Belzer logró una mejora notable en los tiempos de almacenamiento en 1967 [ 32 ] al reportar el almacenamiento exitoso de riñones durante 72 horas tras retomar el uso de perfusión continua con un perfusado a base de plasma canino a 8-12  °C. Belzer [ 33 ] descubrió que el factor crucial para permitir una perfusión sin complicaciones durante 72 horas era la crioprecipitación del plasma utilizado en el perfusado para reducir la cantidad de lipoproteínas inestables que, de otro modo, precipitarían fuera de la solución y obstruirían progresivamente el sistema vascular del riñón. También se utilizó un oxigenador de membrana en el sistema en un intento adicional de prevenir la desnaturalización de las lipoproteínas, ya que solo el 35% de las lipoproteínas se eliminaron mediante crioprecipitación. El perfusado comprendía 1 litro de plasma canino, 4 mEq de sulfato de magnesio , 250 ml de dextrosa , 80 unidades de insulina , 200 000 unidades de penicilina y 100  mg de hidrocortisona . Además de ser crioprecipitado , el perfusado se prefiltró a través de un filtro de 0,22 micras inmediatamente antes de su uso. Belzer utilizó un pH de perfusado de 7,4-7,5, una Po₂ de 150-190  mm Hg y una presión de perfusado de 50-80  mm Hg sistólica, en una máquina que producía un flujo de perfusado pulsátil. Utilizando este sistema, Belzer logró que 6 perros sobrevivieran después de que sus riñones se almacenaran durante 72 horas y luego se reimplantaran, realizándose nefrectomías contralaterales inmediatas en las operaciones de reimplantación.

El uso de hidrocortisona por parte de Belzer como coadyuvante para la preservación había sido sugerido por el trabajo de Lotke con cortes de riñón de perro, [ 34 ] en el que la hidrocortisona mejoró la capacidad de los cortes para excretar PAH y oxígeno después de 30 horas de almacenamiento a 2-4  °C; Lotke sugirió que la hidrocortisona podría estar actuando como un estabilizador de la membrana lisosomal en estos experimentos. Los otros componentes del modelo de Belzer se obtuvieron empíricamente. La insulina y el magnesio se utilizaron parcialmente en un intento de inducir la hibernación artificial , ya que Suomalainen [ 35 ] encontró que este régimen era efectivo para inducir la hibernación en hibernadores naturales. El magnesio también se proporcionó como un inhibidor metabólico después de la demostración de Kamiyama [ 36 ] de que era un agente efectivo en la preservación del corazón de perro. Una justificación adicional para el magnesio fue que era necesario para reemplazar el calcio que había sido unido al citrato en el plasma .

Belzer [ 37 ] demostró la aplicabilidad de sus experimentos con perros al almacenamiento de riñones humanos al informar sobre sus experiencias en trasplantes renales humanos utilizando las mismas técnicas de almacenamiento que había empleado para riñones de perros. Logró almacenar riñones hasta por 50 horas, con solo un 8 % de los pacientes que requirieron diálisis postoperatoria cuando el donante había sido bien preparado.

En 1968, Humphries [ 38 ] informó de un superviviente entre 14 perros tras cinco días de almacenamiento de sus riñones en una máquina de perfusión a 10  °C, utilizando un medio de plasma diluido con ácidos grasos adicionales. Sin embargo, en estos experimentos fue necesaria una nefrectomía contralateral tardía, cuatro semanas después del reimplante, para lograr el éxito, lo que indicaba que los riñones habían sufrido daños graves durante el almacenamiento.

En 1969, Collins [ 39 ] informó de una mejora en los resultados que se podían lograr con métodos simples de almacenamiento hipotérmico de riñón sin perfusión. Basó su técnica en la observación de Keller [ 40 ] de que la pérdida de electrolitos de un riñón durante el almacenamiento podía prevenirse mediante el uso de un líquido de almacenamiento que contenía cationes en cantidades cercanas a las que normalmente están presentes en las células. En el modelo de Collins, los perros estaban bien hidratados antes de la nefrectomía y también se les administró manitol para inducir una diuresis . La fenoxibenzamina, un vasodilatador y estabilizador de enzimas lisosomales, [ 41 ] [ 42 ] se inyectó en la arteria renal antes de la nefrectomía. Los riñones se sumergieron en solución salina inmediatamente después de la extracción y se perfundieron a través de la arteria renal con 100-150 ml de una solución electrolítica fría desde una altura de 100  cm. Los riñones permanecieron en solución salina helada durante el resto del período de almacenamiento. La solución utilizada para estas perfusiones frías exitosas imitaba la composición electrolítica de los fluidos intracelulares al contener grandes cantidades de potasio y magnesio. La solución también contenía glucosa, heparina , procaína y fenoxibenzamina. El pH de la solución era de 7,0 a 25  °C. Collins logró un almacenamiento exitoso de 6 riñones durante 24 horas y de 3 riñones durante 30 horas, con los riñones funcionando inmediatamente después del reimplante, a pesar de las nefrectomías contralaterales inmediatas. Collins enfatizó los malos resultados obtenidos con un lavado con solución de Ringer , al encontrar resultados similares con este manejo en comparación con riñones tratados solo con enfriamiento superficial. Liu [ 43 ] informó que la solución de Collins podía dar un almacenamiento exitoso de 48 horas cuando la solución se modificaba con la inclusión de aminoácidos y vitaminas. Sin embargo, Liu no realizó experimentos de control para demostrar que estas modificaciones eran cruciales.

Otros investigadores encontraron dificultades para repetir los exitosos experimentos de almacenamiento por perfusión de 72 horas de Belzer. Woods [ 44 ] logró un almacenamiento exitoso de 48 horas de 3 de 6 riñones cuando utilizó los aditivos de Belzer con plasma crioprecipitado como perfusado en un sistema de perfusión hipotérmica, pero no pudo extender el tiempo de almacenamiento a 72 horas como lo había hecho Belzer. Sin embargo, Woods [ 45 ] posteriormente logró un almacenamiento exitoso de 3 y 7 días de riñones de perro. Woods había modificado el perfusado de Belzer mediante la adición de 250  mg de metilprednisolona , ​​aumentó el contenido de sulfato de magnesio a 16,2 mEq y la insulina a 320 unidades. Seis de 6 riñones produjeron una función de soporte vital cuando fueron reimplantados después de 72 horas de almacenamiento a pesar de las nefrectomías contralaterales inmediatas; Uno de cada dos riñones mantuvo la función vital tras 96 horas de almacenamiento, uno de cada dos tras 120 horas y uno de cada dos tras 168 horas. La presión del perfusado fue de 60  mm Hg con una frecuencia de bombeo de 70 pulsaciones por minuto, y el pH del perfusado se mantuvo automáticamente en 7,4 mediante un titulador de CO₂ . Woods hizo hincapié en la importancia de la hidratación de los animales donantes y receptores. Sin metilprednisolona, ​​Woods observó que la fragilidad vascular era un problema cuando los tiempos de almacenamiento superaban las 48 horas.

Johnson [ 46 ] y Claes [ 47 ] simplificaron significativamente las técnicas de almacenamiento por perfusión hipotérmica en 1972 con la introducción de un perfusado a base de albúmina. Este perfusado eliminó la necesidad de fabricar el plasma crioprecipitado y filtrado con Millipore utilizado por Belzer. La preparación de este perfusado era laboriosa y requería mucho tiempo, además del riesgo potencial de virus de la hepatitis y anticuerpos citotóxicos. La ausencia de lipoproteínas en el perfusado permitió eliminar el oxigenador de membrana del circuito de perfusión, ya que no era necesario evitar la interfaz perfusado/aire para prevenir la precipitación de lipoproteínas. Ambos investigadores utilizaron los mismos aditivos recomendados por Belzer.

La solución que utilizó Johnson fue preparada por el Laboratorio de Productos Sanguíneos (Elstree: Inglaterra) mediante la extracción de fibrinógeno termolábil y gammaglobulinas del plasma para obtener una solución de fracción de proteína plasmática (PPF). La solución se incubó a 60  °C durante 10 horas para inactivar el agente de la hepatitis sérica. [ 48 ] El resultado fue una solución de albúmina humana de 45 g/L que contenía pequeñas cantidades de gammaglobulinas y betaglobulinas, la cual se mantuvo estable entre 0  °C y 30  °C durante 5 años. [ 49 ] La PPF contenía 2,2  mmol/L de ácidos grasos libres. [ 50 ]

Los experimentos de Johnson [ 46 ] se centraron principalmente en el almacenamiento de riñones dañados por una lesión térmica prolongada. Sin embargo, en un grupo de control de riñones de perros sin lesión térmica, Johnson demostró que la preservación durante 24 horas se lograba fácilmente utilizando un perfusato PPF, y describió en otro lugar [ 51 ] un superviviente tras 72 horas de perfusión y reimplantación con nefrectomía contralateral inmediata. Con riñones con lesión térmica, la perfusión PPF dio mejores resultados que el método de Collins, con 6 de 6 perros supervivientes tras 40 minutos de lesión térmica y 24 horas de almacenamiento, seguido de la reimplantación de los riñones y nefrectomía contralateral inmediata. Se añadieron potasio, magnesio, insulina, glucosa, hidrocortisona y ampicilina a la solución PPF para proporcionar una fuente de energía y prevenir la fuga de potasio intracelular. La temperatura del perfusato fue de 6  °C, la presión de 40–80  mm Hg y la Po2 de 200–400  mm Hg. El pH se mantuvo entre 7,2 y 7,4.

Claes [ 47 ] utilizó un perfusado a base de albúmina humana (Kabi: Suecia) diluida con solución salina a una concentración de 45 g/L. Claes conservó 4 de 5 riñones de perro durante 96 horas, y estos funcionaron inmediatamente después del reimplante, a pesar de las nefrectomías contralaterales inmediatas. Claes también comparó este perfusado con el plasma crioprecipitado de Belzer en un grupo de control y no encontró diferencias significativas en la función de los riñones reimplantados entre ambos grupos.

El único otro grupo además del de Woods que informó sobre el almacenamiento exitoso de riñones durante siete días fue Liu y Humphries [ 52 ] en 1973. Tuvieron tres de siete perros que sobrevivieron, después de que sus riñones fueron almacenados durante siete días seguidos de reimplantación y nefrectomía contralateral inmediata. Su mejor perro tuvo un pico de creatinina post reimplantación de 50  mg/L (0,44  mmol/L). Liu usó perros bien hidratados sometidos a una diuresis de manitol y almacenó los riñones a 9  °C – 10  °C usando un perfusado derivado de PPF humano. El PPF fue fraccionado aún más usando un polímero altamente soluble en agua (Pluronic F-38), y se agregaron acetil triptofanato de sodio y caprilato de sodio al PPF como estabilizadores para permitir la pasteurización. A esta solución se le añadieron albúmina humana, heparina, manitol, glucosa, sulfato de magnesio, cloruro de potasio, insulina, metilprednisolona, ​​carbenicilina y agua para ajustar la osmolalidad a 300-310 mosmol /kg. El perfusado se cambió después de 3,5 días de almacenamiento. La presión del perfusado fue de 60 mm Hg o menos, a una velocidad de bombeo de 60 por minuto. El pH del perfusado fue de 7,12–7,32 (a 37 °C), Pco2 27–47 mm Hg y Po 2 173–219 mm Hg. En un informe posterior sobre este estudio, Humphries [ 53 ] encontró que cuando los experimentos se repitieron con un nuevo lote de PPF no se obtuvieron supervivientes, y la histología de los supervivientes del experimento original mostró hipercelularidad glomerular que atribuyó a un posible efecto tóxico del polímero Pluronic.     

Joyce y Proctor [ 54 ] informaron del uso exitoso de un perfusado simple a base de dextrano para el almacenamiento de riñones de perro durante 72 horas. 10 de 17 riñones fueron viables después del reimplante y la nefrectomía contralateral inmediata. Joyce utilizó perfusión no pulsátil a 4  °C con un perfusado que contenía Dextrano 70 (Pharmacia) 2,1 %, con electrolitos adicionales, glucosa (19,5  g/L), procaína e hidrocortisona. El perfusado no contenía plasma ni componentes plasmáticos. La presión del perfusado fue de solo 30  cm H₂O , pH 7,34-7,40 y Po₂ 250-400 mm  Hg. Este trabajo demostró que, para el almacenamiento de 72 horas, no se necesitaban nutrientes aparte de la glucosa, y las bajas presiones y flujos del perfusado eran adecuados.

En 1973, Sacks [ 55 ] demostró que el simple almacenamiento en hielo podía utilizarse con éxito para un almacenamiento de 72 horas cuando se empleaba una nueva solución de lavado para el enfriamiento inicial y el lavado del riñón. Sacks extrajo los riñones de perros bien hidratados que estaban diuréticos después de una infusión de manitol, y los lavó con 200  ml de solución desde una altura de 100  cm. Los riñones se mantuvieron a 2  °C durante 72 horas sin perfusión adicional. Tras el reimplante, se realizaron nefrectomías contralaterales inmediatas. La solución de lavado se diseñó para imitar la composición del líquido intracelular y contenía manitol como ion impermeable para prevenir aún más la hinchazón celular. La osmolalidad de la solución era de 430  mosmol/kg y su pH era de 7,0 a 2  °C. Los aditivos que había utilizado Collins (dextrosa, fenoxibenzamina, procaína y heparina) fueron omitidos por Sacks.

Estos resultados han sido igualados por Ross [ 56 ] quien también logró un almacenamiento exitoso de 72 horas sin usar perfusión continua, aunque no pudo reproducir los resultados de Collins o Sacks usando las soluciones originales de Collins o Sacks. La solución exitosa de Ross tenía una composición electrolítica similar al líquido intracelular con la adición de citrato hipertónico y manitol. No había fosfato, bicarbonato, cloruro ni glucosa en la solución; la osmolalidad era de 400  mosmol/kg y el pH 7.1. Cinco de 8 perros sobrevivieron al reimplante de sus riñones y nefrectomía contralateral inmediata, cuando los riñones habían sido almacenados durante 72 horas después de haber sido lavados con la solución de Ross; pero Ross no pudo lograr un almacenamiento de 7 días con esta técnica incluso cuando se usó nefrectomía contralateral tardía.

Los requisitos para un almacenamiento exitoso de perfusión hipotérmica de 72 horas han sido definidos más por Collins, quien demostró que la perfusión pulsátil no era necesaria si  se utilizaba una presión de perfusato de 49 mm Hg, y que 7  °C era una mejor temperatura para el almacenamiento que 2  °C o 12  °C. [ 57 ] [ 58 ] También comparó varias composiciones de perfusato y encontró que un perfusato tamponado con fosfato podía usarse con éxito, eliminando así la necesidad de un suministro de dióxido de carbono. [ 57 ] Grundmann [ 59 ] también ha demostrado que una presión baja de perfusato es adecuada. Utilizó una presión pulsátil media de 20  mm Hg en perfusiones de 72 horas y encontró que esto daba mejores resultados que presiones medias de 15, 40, 50 o 60  mm Hg.

Cohen [ 60 ] informó de un almacenamiento exitoso de hasta 8 días utilizando diversos tipos de perfusato, obteniéndose el mejor resultado con un perfusato tamponado con fosfato a 8  °C. Se cree que la imposibilidad de repetir estos experimentos exitosos se debió a cambios en la forma de fabricación del PPF, siendo perjudicial un mayor contenido de ácido octanoico. Se ha demostrado que el ácido octanoico puede estimular la actividad metabólica durante la perfusión hipotérmica [ 61 ] , lo que podría ser perjudicial.

Naturaleza de la lesión por preservación renal

Lesión estructural

Mackay [ 62 ] describió los cambios estructurales que ocurren durante el almacenamiento hipotérmico de 72 horas de riñones previamente intactos, mostrando una vacuolización progresiva del citoplasma celular que afectó particularmente a los túbulos proximales . Mediante microscopía electrónica , se observó que las mitocondrias se hinchaban, con una separación temprana de las membranas cristalinas internas y posterior pérdida de toda la estructura interna. La integridad lisosomal se conservó bien hasta etapas avanzadas, y la destrucción celular no pareció ser causada por enzimas líticas, ya que no se observó mayor daño inmediatamente adyacente a los lisosomas que en el resto de la célula.

Woods [ 45 ] [ 63 ] y Liu [ 52 ] – cuando describieron el almacenamiento exitoso de riñones durante 5 y 7 días – describieron los cambios microscópicos observados al final de la perfusión y en la autopsia, pero encontraron pocas anomalías macroscópicas aparte de cierta infiltración con linfocitos y atrofia tubular ocasional.

Hill [ 64 ] describió los cambios ocurridos durante perfusiones cortas de riñones humanos antes del reimplante, y también realizó biopsias una hora después del mismo. Mediante microscopía electrónica, Hill observó daño endotelial que se correlacionaba con la gravedad del depósito de fibrina tras el reimplante. Los cambios que Hill observó en los glomérulos mediante microscopía óptica consistían en trombos de fibrina ocasionales e infiltración con polimorfonucleares. Hill sospechó que estos cambios eran una lesión de origen inmunológico, pero no encontró correlación entre la gravedad de la lesión histológica y la presencia o ausencia de depósitos de inmunoglobulinas.

Hay varios informes sobre el análisis de la orina producida por los riñones durante el almacenamiento por perfusión. Kastagir [ 65 ] analizó la orina producida durante 24 horas de perfusión y encontró que era un ultrafiltrado del perfusado, Scott [ 66 ] encontró una traza de proteína en la orina durante 24 horas de almacenamiento, y Pederson [ 67 ] encontró solo una traza de proteína después de 36 horas de almacenamiento por perfusión. Pederson mencionó que había encontrado proteinuria intensa durante experimentos anteriores. Woods [ 63 ] observó cilindros de proteína en los túbulos de riñones viables después de 5 días de almacenamiento, pero no analizó la orina producida durante la perfusión. En el estudio de Cohen [ 60 ] hubo un aumento progresivo en la concentración de proteína urinaria durante 8 días de conservación hasta que el contenido de proteína de la orina igualó al del perfusado. Esto pudo haber estado relacionado con la hinchazón de las membranas basales glomerulares y la fusión progresiva de los procesos podocitarios de las células epiteliales que también se observó durante el mismo período de almacenamiento por perfusión.

Mecanismos de lesión

Los mecanismos que dañan los riñones durante el almacenamiento hipotérmico se pueden subdividir de la siguiente manera:

  1. Daño a los procesos metabólicos de la célula causado por:
    1. Frío
    2. Anoxia cuando el riñón está caliente tanto antes como después del período de almacenamiento hipotérmico.
    3. No se le proporcionan los nutrientes correctos.
    4. Acumulación de toxinas en el líquido de perfusión.
    5. Daños tóxicos causados ​​por el líquido de almacenamiento.
    6. Eliminación de sustratos esenciales de las células renales.
  2. Daño al ADN nuclear.
  3. Lesión mecánica del sistema vascular del riñón durante la perfusión hipotérmica.
  4. Lesión posterior al reimplante.

Lesión metabólica

Frío

A temperaturas normales, los mecanismos de bombeo en las paredes celulares retienen el potasio intracelular en niveles altos y expulsan el sodio. Si estas bombas fallan, la célula absorbe sodio y pierde potasio. El agua sigue al sodio pasivamente y produce hinchazón celular. La importancia de este control de la hinchazón celular fue demostrada por McLoughlin [ 68 ] , quien encontró una correlación significativa entre el contenido de agua de la corteza renal canina y la capacidad de los riñones para mantener la vida después de 36 horas de almacenamiento. El mecanismo de bombeo es impulsado por el sistema enzimático conocido como ATPasa activada por Na+K+ [ 69 ] y es inhibido por el frío. Levy [ 70 ] encontró que la actividad metabólica a 10  °C, según lo indicado por las mediciones de consumo de oxígeno, se redujo a aproximadamente el 5% de lo normal y, debido a que todos los sistemas enzimáticos se ven afectados de manera similar por la hipotermia, la actividad de la ATPasa se reduce marcadamente a 10  °C.

Sin embargo, existen diferencias tisulares y de especie en la sensibilidad al frío de esta ATPasa que podrían explicar las diferencias en la capacidad de los tejidos para soportar la hipotermia. Martin [ 71 ] ha demostrado que en las células corticales del riñón de perro, cierta actividad de ATPasa aún está presente a 10  °C, pero no a 0  °C. En las células del hígado y del corazón, la actividad se inhibió completamente a 10 °C, y esta diferencia en la sensibilidad al frío de la ATPasa se correlacionó con la mayor dificultad para controlar la hinchazón celular durante el almacenamiento hipotérmico de las células del hígado y del corazón. Se encuentra una ATPasa distinta en las paredes de los vasos, y Belzer [ 72 ]  demostró que esta se inhibe completamente a 10 °C, mientras que a esta temperatura la ATPasa de las células corticales del riñón aún está activa. Estos experimentos se realizaron en el endotelio aórtico, pero si el endotelio vascular del riñón tiene las mismas propiedades, entonces la lesión vascular podría ser el factor limitante en el almacenamiento prolongado del riñón. 

Willis [ 73 ] ha demostrado cómo los hibernadores obtienen parte de su capacidad para sobrevivir a bajas temperaturas al tener una Na+K+-ATPasa que puede transportar sodio y potasio activamente a través de sus membranas celulares, a 5  °C, aproximadamente seis veces más rápido que en los no hibernadores; esta tasa de transporte es suficiente para evitar la hinchazón celular.

La velocidad de enfriamiento de un tejido también puede ser significativa en la producción de daño a los sistemas enzimáticos. Francavilla [ 74 ] demostró que cuando las secciones de hígado se enfriaban rápidamente (enfriamiento inmediato a 12  °C en 6 minutos), la glucólisis anaeróbica, medida al recalentar a 37  °C, se inhibía en aproximadamente un 67 % de la actividad demostrada en secciones que habían sido sometidas a enfriamiento retardado. Sin embargo, las secciones de riñón de perro se vieron menos afectadas por el enfriamiento rápido que las secciones de hígado.

Anoxemia

Todas las células requieren ATP como fuente de energía para su actividad metabólica. El riñón se daña por anoxia cuando las células corticales renales no pueden generar suficiente ATP en condiciones anaeróbicas para satisfacer sus necesidades. Al extirpar un riñón, cierta anoxia es inevitable en el intervalo entre la división de la arteria renal y el enfriamiento del riñón. Bergstrom [ 75 ] demostró que el 50% del contenido de ATP de las células corticales del riñón de un perro se pierde en 1 minuto después de pinzar la arteria renal, y Warnick [ 76 ] encontró resultados similares en riñones de ratones completos, con una disminución del 50% en el ATP celular después de aproximadamente 30 segundos de anoxia caliente. Warnick y Bergstrom también demostraron que enfriar el riñón inmediatamente después de la extirpación redujo notablemente cualquier pérdida adicional de ATP. Cuando estos riñones no lesionados por calor fueron perfundidos con plasma hipotérmico oxigenado, los niveles de ATP se redujeron en un 50% después de 24 horas de almacenamiento y, después de 48 horas, los niveles medios de ATP tisular fueron un poco más altos, lo que indica que se había producido síntesis de ATP. Pegg [ 77 ] ha demostrado que los riñones de conejo pueden resintetizar ATP después de un período de almacenamiento por perfusión tras una lesión por calor, pero no se produjo resíntesis en los riñones no lesionados por calor.

La anoxia cálida también puede ocurrir durante el reimplante del riñón después del almacenamiento. Lannon [ 78 ] demostró, mediante mediciones del metabolismo del succinato, que el riñón era más sensible a un período de hipoxia cálida que ocurría después del almacenamiento que al mismo período de hipoxia cálida que ocurría inmediatamente antes del almacenamiento.

Falta de nutrientes esenciales

Pettersson [ 79 ] y Cohen [ 60 ] demostraron el metabolismo activo de la glucosa con producción de bicarbonato .

Los estudios de Pettersson [ 79 ] se centraron en el metabolismo de la glucosa y los ácidos grasos por los riñones durante 6 días de almacenamiento por perfusión hipotérmica, y encontró que los riñones consumían glucosa a 4,4 μmol/g/día y ácidos grasos a 5,8 μmol/g/día. En el estudio de Cohen [ 60 ], los mejores riñones almacenados durante 8 días consumieron glucosa a una tasa de 2,3 μmol/g/día y 4,9 μmol/g/día respectivamente, lo que hizo probable que estuvieran utilizando ácidos grasos a tasas similares a las de los riñones de los perros de Pettersson. La constancia tanto de la tasa de consumo de glucosa como de la tasa de producción de bicarbonato implicó que no había daño que afectara a los sistemas enzimáticos de la enzima glucolítica o la anhidrasa carbónica.

Lee [ 80 ] demostró que los ácidos grasos eran el sustrato preferido de la corteza renal del conejo a temperaturas normotérmicas, y la glucosa el sustrato preferido para las células medulares que normalmente metabolizan anaeróbicamente. Abodeely [ 81 ] demostró que tanto los ácidos grasos como la glucosa podían ser utilizados por la médula externa del riñón del conejo, pero que la glucosa se utilizaba preferentemente. En hipotermia, las necesidades metabólicas del riñón se reducen mucho, pero se produce un consumo medible de glucosa, ácidos grasos y cuerpos cetónicos. Horsburgh [ 50 ] demostró que los riñones hipotérmicos utilizan lípidos, con un consumo de palmitato del 0-15% de lo normal en la corteza renal de la rata a 15  °C. Pettersson [ 79 ] demostró que, en base molar, la glucosa y los ácidos grasos eran metabolizados por riñones perfundidos hipotérmicamente a velocidades aproximadamente iguales. Huang [ 82 ] demostró que la corteza del riñón hipotérmico de perro perdía lípidos (35 % de pérdida total de lípidos después de 24 horas) a menos que se añadiera oleato al líquido de perfusión renal. Huang comentó que esta pérdida podría afectar la estructura celular y que también sugería que el riñón estaba utilizando ácidos grasos. En una publicación posterior, Huang [ 83 ] demostró que las secciones de corteza renal de perro metabolizaban ácidos grasos, pero no glucosa, a 10  °C.

Aunque se proporcionen los nutrientes correctos, estos pueden perderse por absorción en los tubos del sistema de preservación. Lee [ 84 ] demostró que el caucho de silicona (un material ampliamente utilizado en sistemas de preservación renal) absorbió el 46 % del ácido oleico de un perfusado después de 4 horas de perfusión.

Acumulación de toxinas

Abouna [ 85 ] demostró que se liberaba amoníaco en el perfusado durante el almacenamiento de riñón de 3 días, y sugirió que esto podría ser tóxico para las células renales a menos que se eliminara mediante el reemplazo frecuente del perfusado. Liu [ 52 ] proporcionó cierto apoyo para el uso del intercambio de perfusado durante perfusiones largas , quien utilizó el intercambio de perfusado en sus exitosos experimentos de almacenamiento de 7 días. Grundmann [ 86 ] también encontró que la calidad de la preservación de 96 horas mejoraba con el uso de un volumen doble de perfusado o con el intercambio de perfusado. Sin embargo, las conclusiones de Grundmann se basaron en comparaciones con un grupo de control de solo 3 perros. Cohen [ 60 ] no pudo demostrar ninguna producción de amoníaco durante 8 días de perfusión y ningún beneficio del intercambio de perfusado; se demostró que la alcalinidad progresiva que ocurrió durante la perfusión se debía a la producción de bicarbonato.

Daños tóxicos causados ​​por el perfusado

Se ha demostrado que ciertos perfusados ​​tienen efectos tóxicos en los riñones como resultado de la inclusión inadvertida de ciertos químicos en su formulación. Collins [ 87 ] demostró que la procaína incluida en la formulación de sus fluidos de lavado podía ser tóxica, y Pegg [ 88 ] ha comentado cómo los materiales tóxicos, como los plastificantes de PVC, pueden ser eliminados de los tubos del circuito de perfusión. Dvorak [ 89 ] demostró que la adición de metilprednisolona al perfusado que Woods [ 63 ] consideraba esencial podría ser perjudicial en algunas circunstancias. Demostró que con más  de g de metilprednisolona en 650  mL de perfusado (en comparación con los 250  mg en 1 litro utilizados por Woods) se produjeron cambios hemodinámicos y estructurales irreversibles en el riñón después de 20 horas de perfusión. Hubo necrosis de las asas capilares, oclusión de los espacios de Bowman, engrosamiento de la membrana basal y daño de las células endoteliales.

Eliminación de sustratos esenciales

Warnick [ 76 ] consideró que el nivel de nucleótidos que permanecen en la célula tras el almacenamiento era importante para determinar si la célula sería capaz de resintetizar ATP y recuperarse tras el recalentamiento. El cambio frecuente del perfusado o el uso de un gran volumen de perfusado presenta la desventaja teórica de que los nucleótidos de adenina degradados pueden ser eliminados de las células y, por lo tanto, no estar disponibles para la resintetización en ATP cuando el riñón se recalienta.

Daño al ADN nuclear

El ADN nuclear se daña durante el almacenamiento en frío de los riñones. Lazarus [ 90 ] demostró que se producían roturas de ADN monocatenario en un plazo de 16 horas en riñones de ratones almacenados hipotérmicamente, y que el daño se inhibía ligeramente al almacenarlos en soluciones de Collins o Sacks. Este daño nuclear difería del observado en condiciones de calor, donde se producían roturas de ADN bicatenario. [ 91 ]

Lesión mecánica del sistema vascular

Los métodos de almacenamiento por perfusión pueden dañar mecánicamente el endotelio vascular del riñón, lo que conduce a trombosis arterial o depósito de fibrina después del reimplante. Hill [ 64 ] observó que, en riñones humanos, el depósito de fibrina en el glomérulo después del reimplante y la función postoperatoria se correlacionaban con la duración del almacenamiento por perfusión. Tomó biopsias durante la revascularización de riñones humanos conservados por perfusión o almacenamiento en hielo, y demostró mediante microscopía electrónica que la disrupción endotelial solo se produjo en aquellos riñones que habían sido perfundidos. Las biopsias tomadas una hora después de la revascularización mostraron plaquetas y fibrina adheridas a cualquier área de membrana basal vascular denudada. Sheil [ 92 ] describió un tipo diferente de daño vascular , mostrando cómo se podía producir una lesión por chorro distal a la cánula conectada a la arteria renal, lo que conducía a trombosis arterial aproximadamente 1  cm distal al sitio de la cánula.

Lesión posterior a la reimplantación

Existe evidencia de que los mecanismos inmunológicos pueden dañar los riñones perfundidos hipotérmicamente después del reimplante si el perfusado contenía anticuerpos específicos. Cross [ 93 ] describió dos pares de riñones de cadáveres humanos que fueron perfundidos simultáneamente con plasma crioprecipitado que contenía anticuerpos HLA específicos de tipo para uno de los pares. Ambos riñones sufrieron trombosis arterial temprana. Light [ 94 ] describió un rechazo hiperagudo similar después del almacenamiento por perfusión y mostró que el plasma crioprecipitado utilizado contenía anticuerpos IgM citotóxicos. Este peligro potencial del uso de plasma crioprecipitado fue demostrado experimentalmente por Filo [ 95 ] quien perfundió riñones de perro durante 24 horas con plasma de perro crioprecipitado específicamente sensibilizado y encontró que podía inducir lesiones glomerulares y vasculares con congestión capilar, hinchazón endotelial, infiltración por leucocitos polimorfonucleares y trombosis arterial. La microscopía de inmunofluorescencia demostró la unión específica de IgG a lo largo de las superficies endoteliales, en los glomérulos y también en los vasos sanguíneos. Tras el reimplante, la fijación del complemento y el daño tisular se produjeron de forma similar. Se observó cierta correlación entre la gravedad del daño histológico y la función renal posterior.

Muchos trabajadores han intentado evitar el recalentamiento de los riñones durante el reimplante, pero solo Cohen ha descrito el uso de un sistema de enfriamiento activo. [ 60 ] Las mediciones de la liberación de enzimas lisosomales de riñones sometidos a anastomosis simuladas, tanto dentro como fuera del sistema de enfriamiento, demostraron la sensibilidad de los riñones al recalentamiento tras un período de almacenamiento en frío y confirmaron la eficacia del sistema de enfriamiento para prevenir la liberación de enzimas. Otro factor que contribuyó a minimizar las lesiones en las operaciones de reimplante pudo haber sido que los riñones se mantuvieron a 7  °C dentro de la bobina de enfriamiento, que estaba dentro de un grado de la temperatura utilizada durante el almacenamiento por perfusión, de modo que los riñones no estuvieron sujetos a los mayores cambios de temperatura que habrían ocurrido si se hubiera utilizado enfriamiento con hielo.

Dempster [ 96 ] describió el uso de la liberación lenta de las pinzas vasculares al final de las operaciones de reimplantación renal para evitar lesiones en el riñón, pero otros investigadores no han mencionado si utilizaron o no esta maniobra. Después de que Cohen encontrara lesiones vasculares con hemorragia intrarrenal tras 3 días de almacenamiento en perfusión, [ 60 ] se utilizó una técnica de revascularización lenta para todos los experimentos posteriores, con el objetivo de dar tiempo a los vasos intrarrenales para recuperar su tono lo suficiente como para evitar que se aplicara la presión sistólica completa a los frágiles vasos glomerulares. La ausencia de lesiones vasculares macroscópicas en sus perfusiones posteriores puede atribuirse al uso de esta maniobra.

Véase también

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