Recombinación específica del sitio

La recombinación sitio-específica , también conocida como recombinación sitio-específica conservativa , es un tipo de recombinación genética en la que se produce un intercambio de hebras de ADN entre segmentos que poseen al menos un cierto grado de homología de secuencia . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} Las enzimas conocidas como recombinasas sitio-específicas (SSR) realizan reordenamientos de segmentos de ADN al reconocer y unirse a secuencias de ADN cortas y específicas (sitios), en las que cortan el esqueleto del ADN, intercambian las dos hélices de ADN involucradas y vuelven a unir las hebras de ADN. En algunos casos, la presencia de una enzima recombinasa y los sitios de recombinación es suficiente para que la reacción proceda; en otros sistemas se requieren varias proteínas accesorias y/o sitios accesorios. Muchas estrategias diferentes de modificación del genoma , entre ellas el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), un enfoque avanzado para la introducción dirigida de unidades de transcripción en loci genómicos predeterminados, se basan en SSR.

Los sistemas de recombinación sitio-específica son altamente específicos, rápidos y eficientes, incluso ante genomas eucariotas complejos. ^{[ 4 ]} Se emplean de forma natural en diversos procesos celulares, como la replicación del genoma bacteriano , la diferenciación y la patogénesis , y el movimiento de elementos genéticos móviles . ^{[ 5 ]} Por las mismas razones, representan una base potencial para el desarrollo de herramientas de ingeniería genética . ^{[ 6 ]}

Los sitios de recombinación suelen tener entre 30 y 200 nucleótidos de longitud y constan de dos motivos con simetría de repetición invertida parcial, a los que se une la recombinasa, y que flanquean una secuencia de entrecruzamiento central donde tiene lugar la recombinación. Los pares de sitios entre los que se produce la recombinación suelen ser idénticos, pero existen excepciones (por ejemplo, attP y attB de la integrasa λ ). ^{[ 7 ]}

Basándose en las homologías de secuencias de aminoácidos y la relación mecanística, la mayoría de las recombinasas sitio-específicas se agrupan en dos familias: la familia de recombinasas de tirosina (Tyr) o la familia de recombinasas de serina (Ser) . Los nombres derivan del residuo de aminoácido nucleofílico conservado presente en cada clase de recombinasa, que se utiliza para atacar el ADN y que se une covalentemente a él durante el intercambio de hebras. Los primeros miembros identificados de la familia de recombinasas de serina se conocían como resolvasas o invertasas de ADN , mientras que el miembro fundador de las recombinasas de tirosina, la integrasa del fago lambda (que utiliza sitios de reconocimiento attP/B), difiere de las enzimas ahora bien conocidas como Cre (del fago P1 ) y FLP (de la levadura Saccharomyces cerevisiae ). Entre las recombinasas de serina más conocidas se encuentran enzimas como la resolvasa gamma-delta (del transposón Tn 1000 ), la resolvasa Tn3 (del transposón Tn3) y la integrasa φ C31 (del fago φ C31). ^{[ 8 ]} Existen varias clases de recombinasas de serina, que incluyen la recombinasa de serina pequeña, la resolvasa ISXc5, la transposasa de serina y la recombinasa de serina grande. ^{[ 9 ]}

Aunque los miembros individuales de las dos familias de recombinasas pueden realizar reacciones con los mismos resultados prácticos, las familias no están relacionadas entre sí, ya que presentan estructuras proteicas y mecanismos de reacción diferentes. A diferencia de las recombinasas de tirosina, las recombinasas de serina son altamente modulares, como sugirieron inicialmente estudios bioquímicos ^{[ 10 ]} y posteriormente demostraron estructuras cristalográficas ^{[ 11 , 12 ]} . El conocimiento de estas estructuras proteicas podría resultar útil al intentar rediseñar las proteínas recombinasas como herramientas para la manipulación genética ^.

La recombinación entre dos sitios de ADN comienza con el reconocimiento y la unión de estos sitios —un sitio en cada una de dos moléculas de ADN bicatenario separadas, o al menos dos segmentos distantes de la misma molécula— por la enzima recombinasa. A esto le sigue la sinapsis , es decir, la unión de los sitios para formar el complejo sináptico. Es dentro de este complejo sináptico donde tiene lugar el intercambio de hebras, ya que el ADN se corta y se vuelve a unir mediante reacciones de transesterificación controladas . Durante el intercambio de hebras, cada molécula de ADN bicatenario se corta en un punto fijo dentro de la región de entrecruzamiento del sitio de reconocimiento, liberando un grupo hidroxilo de desoxirribosa , mientras que la enzima recombinasa forma un enlace covalente transitorio con un fosfato del esqueleto del ADN . Este enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo del residuo de serina o tirosina nucleofílico conserva la energía que se gastó en el corte del ADN. La energía almacenada en este enlace se utiliza posteriormente para la unión del ADN al grupo hidroxilo de la desoxirribosa correspondiente en la otra molécula de ADN. Por lo tanto, toda la reacción se lleva a cabo sin necesidad de cofactores externos ricos en energía, como el ATP .

Aunque la reacción química básica es la misma para las recombinasas de tirosina y serina, existen algunas diferencias entre ellas. ^{[ 13 ]} Las recombinasas de tirosina, como Cre o FLP , cortan una hebra de ADN a la vez en puntos escalonados por 6–8 pb, uniendo el extremo 3' de la hebra al grupo hidroxilo del nucleófilo de tirosina (Fig. 1). ^{[ 14 ]} El intercambio de hebras procede entonces a través de un intermedio de hebras cruzadas análogo a la unión de Holliday en la que solo se ha intercambiado un par de hebras. ^{[ 15 ] [ 16 ]}

El mecanismo y el control de las recombinasas de serina se comprenden mucho menos. Este grupo de enzimas se descubrió a mediados de la década de 1990 y aún es relativamente pequeño. Los miembros clásicos, como la resolvasa gamma-delta y Tn3 , así como nuevas incorporaciones como las integrasas φC31, Bxb1 y R4, cortan simultáneamente las cuatro hebras de ADN en puntos escalonados por 2 pb (Fig. 2). ^{[ 17 ]} Durante la escisión, se forma un enlace proteína-ADN mediante una reacción de transesterificación , en la que un enlace fosfodiéster se reemplaza por un enlace fosfoserina entre un fosfato 5' en el sitio de escisión y el grupo hidroxilo del residuo de serina conservado (S10 en la resolvasa). ^{[ 18 ] [ 19 ]}

Todavía no está del todo claro cómo ocurre el intercambio de hebras después de que el ADN se ha escindido. Sin embargo, se ha demostrado que las hebras se intercambian mientras están unidas covalentemente a la proteína, con una rotación neta resultante de 180°. ^{[ 20 ] [ 21 ]} El modelo más citado (pero no el único) que explica estos hechos es el "modelo de rotación de subunidades" (Fig. 2). ^{[ 13 ] [ 22 ]} Independientemente del modelo, los dúplex de ADN se sitúan fuera del complejo proteico, y se necesita un gran movimiento de la proteína para lograr el intercambio de hebras. En este caso, los sitios de recombinación son ligeramente asimétricos, lo que permite a la enzima distinguir los extremos izquierdo y derecho del sitio. Al generar productos, los extremos izquierdos siempre se unen a los extremos derechos de sus sitios asociados, y viceversa. Esto hace que se reconstituyan diferentes sitios híbridos de recombinación en los productos de recombinación. La unión de los extremos izquierdos con los izquierdos o de los derechos con los derechos se evita debido a la secuencia de "superposición" asimétrica entre los puntos escalonados de intercambio de la hebra superior e inferior, lo que contrasta marcadamente con el mecanismo empleado por las recombinasas de tirosina. ^{[ 13 ]}

La reacción catalizada por la recombinasa Cre, por ejemplo, puede dar lugar a la escisión del segmento de ADN flanqueado por los dos sitios (Fig. 3A), pero también a la integración o inversión de la orientación del segmento de ADN flanqueado (Fig. 3B). El resultado de la reacción depende principalmente de la ubicación y orientación relativas de los sitios que se recombinarán, pero también de la especificidad intrínseca del sistema de recombinación sitio-específica en cuestión. Las escisiones e inversiones ocurren si la recombinación se produce entre dos sitios ubicados en la misma molécula (recombinación intramolecular), y si los sitios se encuentran en la misma orientación ( repetición directa ) o en orientación opuesta ( repetición invertida ), respectivamente. Las inserciones, por otro lado, se producen si la recombinación ocurre en sitios situados en dos moléculas de ADN diferentes (recombinación intermolecular), siempre que al menos una de estas moléculas sea circular. La mayoría de los sistemas específicos de sitio están altamente especializados, catalizan solo uno de estos diferentes tipos de reacción y han evolucionado para ignorar los sitios que se encuentran en la orientación "incorrecta".

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