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Phi X 174

Estructura de la cápside del fago ΦX174 Dibujo esquemático de un virión del virus Sins- Heimer ( también conocido como microvirus Phix174 ) El bacteriófago phi X 174 (o ΦX174 ) ...

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Estructura de la cápside del fago ΦX174
Dibujo esquemático de un virión del virus Sins- Heimer( también conocido como microvirusPhix174 )

El bacteriófago phi X 174 (o ΦX174 ) es un virus de ADN monocatenario ( ssDNA ) que infecta a Escherichia coli . Este virus fue aislado en 1935 por Nicolas Bulgakov [ 1 ] en el laboratorio de Félix d'Hérelle en el Instituto Pasteur , a partir de muestras recogidas en las alcantarillas de París. Su caracterización y el estudio de su mecanismo de replicación se llevaron a cabo desde la década de 1950 en adelante. Fue el primer genoma basado en ADN en ser secuenciado. Este trabajo fue completado por Fred Sanger y su equipo en 1977. [ 2 ] En 1962, Walter Fiers y Robert L. Sinsheimer ya habían demostrado la circularidad física, cerrada covalentemente, del ADN ΦX174. [ 3 ] El ganador del premio Nobel Arthur Kornberg usó ΦX174 como modelo para probar por primera vez que el ADN sintetizado en un tubo de ensayo por enzimas purificadas podía producir todas las características de un virus natural, dando paso a la era de la biología sintética . [ 4 ] [ 5 ] En 1972–1974, Jerard Hurwitz , Sue Wickner y Reed Wickner con colaboradores identificaron los genes necesarios para producir las enzimas que catalizan la conversión de la forma monocatenaria del virus a la forma replicativa bicatenaria. [ 6 ] En 2003, el grupo de Craig Venter informó que el genoma de ΦX174 fue el primero en ser ensamblado completamente in vitro a partir de oligonucleótidos sintetizados. [ 7 ] La partícula del virus ΦX174 también se ha ensamblado con éxito in vitro . [ 8 ] En 2012, se demostró cómo su genoma altamente superpuesto puede descomprimirse completamente y seguir siendo funcional. [ 9 ]

genoma

Genoma del bacteriófago ΦX174 que muestra sus 11 genes [ 10 ]

Este bacteriófago posee un genoma de ADN monocatenario circular con sentido positivo de 5386 nucleótidos . [ 10 ] El contenido de GC del genoma es del 44 % y el 95 % de los nucleótidos pertenecen a genes codificantes. Debido al patrón de bases equilibrado del genoma, se utiliza como ADN de control para secuenciadores Illumina.

Genes

ΦX174 codifica 11 genes, nombrados como letras consecutivas del alfabeto en el orden en que fueron descubiertos, con la excepción de A*, que es un codón de inicio alternativo dentro de los genes A grandes. Se cree que solo los genes A* y K no son esenciales, aunque hay cierta duda sobre A* porque su codón de inicio podría cambiarse a ATT pero no a ninguna otra secuencia. [ 11 ] Ahora se sabe que el ATT probablemente todavía es capaz de producir proteína dentro de E. coli [ 12 ] y por lo tanto, este gen podría ser esencial.

La primera mitad del genoma ΦX174 presenta altos niveles de solapamiento genético [ 13 ] , con ocho de los once genes solapados por al menos un nucleótido [ 2 ] . Se ha demostrado que estos solapamientos no son esenciales [ 9 ], aunque el fago modificado, con todos los solapamientos genéticos eliminados, mostró una menor aptitud que el tipo silvestre [ 14 ] .

El fago ΦX174 se ha utilizado para intentar establecer la ausencia de información genética no descubierta mediante un enfoque de "prueba por síntesis". [ 15 ]

Transcriptoma

En 2020, se generó el transcriptoma de ΦX174. [ 16 ] Las características notables del transcriptoma de ΦX174 son una serie de hasta cuatro promotores relativamente débiles en serie con hasta cuatro terminadores independientes de Rho (intrínsecos) y un terminador dependiente de Rho.

Proteínas

ΦX174 codifica 11 proteínas .

Proteoma

Recientemente se ha informado de la identificación de todas las proteínas ΦX174 mediante espectrometría de masas. [ 14 ]

Ciclo de infección

La infección comienza cuando la proteína G se une a los lipopolisacáridos en la superficie de la célula bacteriana huésped. La proteína H (o proteína piloto de ADN) guía el genoma viral a través de la membrana bacteriana de la bacteria E. coli [ 18 ], muy probablemente a través de una hélice de dominio transmembrana N-terminal predicha . [ 19 ] Sin embargo, se ha hecho evidente que la proteína H es una proteína multifuncional. [ 20 ] Esta es la única proteína de la cápside viral de ΦX174 que carece de una estructura cristalina por un par de razones. Tiene un bajo contenido aromático y un alto contenido de glicina , lo que hace que la estructura de la proteína sea muy flexible y, además, los átomos de hidrógeno individuales (el grupo R para las glicinas) son difíciles de detectar en la cristalografía de proteínas. Adicionalmente, la proteína H induce la lisis del huésped bacteriano a altas concentraciones, ya que la hélice transmembrana N-terminal predicha perfora fácilmente la pared bacteriana. Mediante bioinformática , esta proteína contiene cuatro dominios de hélice enrollada predichos que tienen una homología significativa con factores de transcripción conocidos. Además, se determinó que la proteína H de novo era necesaria para la síntesis óptima de otras proteínas virales. [ 21 ] Las mutaciones en la proteína H que impiden la incorporación viral pueden superarse cuando se suministran cantidades excesivas de la proteína B, la proteína de andamiaje interna.

El ADN se expulsa a través de un canal hidrofílico en el vértice de simetría quíntuple. [ 22 ] Se sabe que la proteína H reside en esta área, pero la evidencia experimental no ha verificado su ubicación exacta. Una vez dentro de la bacteria huésped, la replicación del genoma de ADN monocatenario positivo procede a través de un intermediario de ADN de sentido negativo . Esto se realiza cuando el genoma del fago se superenrolla y la estructura secundaria formada por dicho superenrollamiento atrae un complejo proteico primosoma . Este se transloca una vez alrededor del genoma y sintetiza un ADN monocatenario negativo a partir del genoma positivo original. Los genomas de ADN monocatenario positivo que se empaquetan en los virus se crean a partir de esto mediante un mecanismo de círculo rodante. Este es el mecanismo por el cual el genoma superenrollado de doble cadena es cortado en la cadena positiva por una proteína A codificada por el virus, atrayendo también una ADN polimerasa bacteriana (DNAP) al sitio de corte. La DNAP utiliza la cadena negativa como plantilla para hacer ADN de sentido positivo. A medida que se desplaza por el genoma, desplaza la hebra externa del ADN ya sintetizado, que es recubierta inmediatamente por proteínas SSBP . La proteína A escinde el genoma completo cada vez que reconoce la secuencia de origen.

Como la proteína D es el transcrito génico más abundante, también es la proteína más abundante en la procápside viral. De manera similar, los transcritos génicos de F, J y G son más abundantes que el de H, ya que la estequiometría de estas proteínas estructurales es 5:5:5:1. Los primosomas son complejos proteicos que unen la enzima helicasa al molde. Los primosomas proporcionan cebadores de ARN para la síntesis de ADN en las hebras.

Tasa de mutación

Se estima que la tasa de mutación de phiX174 es de 1,0 × 10 −6 sustituciones por base por ronda de copia, un valor que es consistente con la regla de Drake (0,003 mutaciones por genoma por ronda de copia en microorganismos basados ​​en ADN). [ 23 ]

Recombinación

PhiX174 es capaz de experimentar recombinación genética . Con base en las frecuencias de recombinación obtenidas en cruces genéticos, se construyó un mapa genético. [ 24 ] La recombinación en phi X174 está asociada con una alta interferencia negativa, es decir, una correlación positiva (interferencia negativa) de eventos recombinacionales (ver wikipedia interferencia de entrecruzamiento ). [ 24 ]

Filogenética y diversidad

ΦX174 está estrechamente relacionado con otros microvirus , especialmente con el fago NC (por ejemplo, NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51, etc.) y más distantemente relacionado con los fagos tipo G4 e incluso más distantemente relacionado con el fago tipo α3. Rokyta et al. 2006 presentaron un árbol filogenético de sus relaciones. [ 25 ]

Usos

Evolución experimental

ΦX174 se ha utilizado como organismo modelo en muchos experimentos de evolución. [ 26 ]

Biotecnología

ΦX174 se utiliza habitualmente como control positivo en la secuenciación de ADN debido a su tamaño genómico relativamente pequeño en comparación con otros organismos, su contenido de nucleótidos relativamente equilibrado: alrededor del 23 % de G, 22 % de C, 24 % de A y 31 % de T, es decir, 45 % de G+C y 55 % de A+T, véase el número de acceso NC_001422.1 [ 10 ] para su secuencia de 5386 nucleótidos. Los instrumentos de secuenciación de Illumina utilizan ΦX174 como control positivo, [ 27 ] y una sola corrida de secuenciación de Illumina puede cubrir el genoma de ΦX174 varios millones de veces, lo que lo convierte muy probablemente en el genoma más secuenciado de la historia.

ΦX174 también se utiliza para probar la resistencia de los equipos de protección personal a los virus transmitidos por la sangre. [ 28 ]

ΦX174 también ha sido modificado para permitir la presentación de péptidos (presentación de fagos) a partir de la proteína G de la cápside viral. [ 29 ]

Biología sintética

El genoma de ΦX174 fue el primer fago clonado en levadura, [ 9 ] lo que proporciona un entorno ideal para modificaciones genómicas. [ 30 ] ΦX174 también fue el primer genoma completamente descomprimido, eliminando todas las superposiciones de genes. [ 13 ] El efecto de estos cambios resultó en una unión al huésped significativamente reducida, desregulación de la expresión de proteínas y sensibilidad al calor. [ 14 ]

Véase también

Referencias

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