Sistema de transposones PiggyBac

El sistema de transposones PiggyBac (PB) emplea una enzima transposasa modificada genéticamente para insertar un gen en el genoma celular. Se basa en el elemento transponible natural PiggyBac (PB) , lo que permite el movimiento bidireccional de genes entre cromosomas y vectores genéticos como plásmidos mediante un mecanismo de "corte y pegado". Durante la transposición, la transposasa PB reconoce secuencias de repetición terminal invertida (ITR) específicas del transposón, ubicadas en ambos extremos del vector, y traslada eficientemente el contenido desde los sitios originales, integrándolo en los sitios cromosómicos TTAA. La potente actividad del sistema de transposones PiggyBac permite movilizar fácilmente genes de interés entre las dos ITR del vector PB hacia los genomas diana. El transposón PiggyBac, específico para TTAA, se está convirtiendo rápidamente en una herramienta muy útil para la ingeniería genética de una amplia variedad de especies, especialmente insectos. ^{[ 1 ]} Fueron descubiertos en 1989 por Malcolm Fraser en la Universidad de Notre Dame . ^{[ 2 ] [ 3 ]} En 2010 se descubrió y patentó una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac llamada Super piggyBac. ^{[ 4 ]} Super piggyBac es un sistema de transposasa hiperactivo que permite una integración genética eficiente y estable sin limitaciones de tamaño, lo que lo hace ideal para introducir cargas genéticas complejas en células difíciles de transfectar, como células primarias (es decir, células T) y células madre, lo que agiliza los flujos de trabajo de descubrimiento de fármacos en tipos de células sensibles o refractarias. ^{[ 5 ]}

Los elementos de repetición corta específicos de TTAA son un grupo de transposones que comparten similitud en estructura y propiedades de movimiento. Estos elementos se definieron originalmente en la oruga de la col ^{[ 6 ]} , pero parecen ser comunes también entre otros animales. Podrían resultar herramientas útiles para la transformación de insectos. La identificación original de estos inusuales elementos específicos de TTAA se produjo a través de una ruta algo poco convencional en comparación con la mayoría de los demás elementos móviles de Clase II. Se observó que surgían mutantes espontáneos de morfología de placa de baculovirus durante la propagación de estos virus en la línea celular TN-368. La caracterización genética de estas mutaciones a menudo reveló una inserción asociada de ADN derivado del huésped, algunos de los cuales parecían ser transposones.

Se han identificado varias inserciones de ADN del huésped móvil dentro del locus de pocos poliedros (FP) de los baculovirus AcMNPV y GmMNPV. Las inserciones más estudiadas son las ahora denominadas tagalong (anteriormente TFP3) y piggyBac (anteriormente IFP2). Estas inserciones muestran una preferencia única por los sitios diana TTAA, ya sea insertándose dentro del locus FP viral o en otras regiones del genoma viral. Ambos elementos forman parte de una familia más amplia de elementos de inserción específicos del sitio diana TTAA que incluye los elementos piggyBac y tagalong derivados de T. ni, los elementos IFP1.6 y la inserción de 290 pb de Carstens derivados de Spodoptera frugiperda, y la inserción tipo transposón dentro de la región EcoRI-J,N del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica, cuyo origen no está definido.

Más recientemente, el análisis de secuencias obtenidas del genoma humano ha revelado lo que parecen ser entre 100 y 500 copias de un elemento fósil llamado LOOPER, que tiene homología de secuencia con piggyBac, termina en 5' CCY....GGG 3' y aparentemente se dirige a sitios de inserción de TTAA. La secuencia consenso de LOOPER es en promedio un 77% similar a secuencias individuales identificadas en el genoma humano, lo que indica que tiene al menos 60 millones de años. Hay otros dos elementos repetitivos fósiles específicos de TTAA, MER75 y MER85 (estimados en 2000 copias por genoma) que parecen dirigirse a sitios de inserción de TTAA y terminan en 5' CCC....GGG 3'. Se acumula evidencia que sugiere que existe una superfamilia de elementos móviles específicos de TTAA en una diversidad de organismos, y que las secuencias relacionadas con piggyBac pueden estar presentes en una diversidad de especies. ^{[ 7 ]}

El transposón consta del gen de la transposasa flanqueado por repeticiones terminales invertidas.

La transposasa de la superfamilia PB consta de tres dominios: un dominio N-terminal variable, un dominio catalítico de tríada DDE y una región C-terminal con la señal de localización nuclear. ^{[ 8 ]}

Aparentemente, se ha domesticado en una amplia gama de animales, perdiendo las repeticiones y, por lo tanto, su movilidad. Las nuevas funciones que adquieren estas copias a veces son lo suficientemente significativas como para mostrar signos de selección positiva o purificadora. En los humanos, estos genes son: ^{[ 9 ]}

• PGBD1 , PGBD2 (linaje de mamíferos), PGBD3 , PGBD4 (primates), PGBD5 ( miomerozoos )

Las versiones hiperactivas de la transposasa PiggyBac son adecuadas para fines de ingeniería genética. ^{[ 10 ]} Se creó una versión llamada mPB optimizando el uso de codones para mamíferos (ratón) con un aumento de 20 veces en la actividad, ^{[ 11 ]} y un posterior cribado de mutaciones generó hyPB con 10 veces la actividad de mPB. ^{[ 12 ]} El sistema PiggyBac se ha empleado con éxito para expresar grandes secuencias genéticas, como un sistema de interferencia CRISPR inducible por doxiciclina. ^{[ 13 ]}

Un nuevo miembro de la familia piggyBac, la transposasa hiperactiva Mage (MG) (hyMageasa), mostró una fuerte transponibilidad en una variedad de células de mamíferos y células T primarias, y una preferencia de inserción más débil por genes cercanos, sitios de inicio de transcripción, islas CpG y sitios hipersensibles a la DNasa I en comparación con piggyBac. ^{[ 14 ]}

Estos elementos fueron identificados inicialmente como inserciones en mutantes de baculovirus por el Dr. Malcolm Fraser, ^{[ 7 ]} profesor de la Universidad de Notre Dame , y se denominaron originalmente IFP (Inserciones en mutantes FP). Posteriormente, el nombre se cambió a TFP (Transposón en FP). Finalmente, se adoptó el nombre PiggyBac para mantener el interés del público y para que tuviera cierta semejanza con la nomenclatura genética de Drosophila .

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