Hispanopedia WikiLa secuenciación Polony es una técnica de secuenciación multiplex económica pero de alta precisión que permite leer millones de secuencias de ADN inmovilizadas en paralelo. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el grupo del Dr. George Church en la Facultad de Medicina de Harvard . A diferencia de otras técnicas de secuenciación, la tecnología de secuenciación Polony es una plataforma abierta con software y protocolos de código abierto de descarga gratuita. Además, el hardware de esta técnica se puede configurar fácilmente con un microscopio de epifluorescencia común y un sistema de flujo/fluídico controlado por computadora. La secuenciación Polony se realiza generalmente en una biblioteca de etiquetas de extremos apareados , donde cada molécula de ADN molde tiene una longitud de 135 pb con dos etiquetas genómicas apareadas de 17-18 pb separadas y flanqueadas por secuencias comunes. La longitud de lectura actual de esta técnica es de 26 bases por amplicón y 13 bases por etiqueta, dejando un espacio de 4-5 bases en cada etiqueta.
Flujo de trabajo
El protocolo de secuenciación de Polony se puede dividir en tres partes principales: la construcción de la biblioteca de etiquetas de extremos emparejados, la amplificación de la plantilla y la secuenciación del ADN .
Construcción de bibliotecas de etiquetas finales emparejadas
Este protocolo comienza cortando aleatoriamente el ADN genómico analizado en una distribución de tamaño estrecha. Las moléculas de ADN cortadas se someten luego al tratamiento de reparación de extremos y de cola de A. El tratamiento de reparación de extremos convierte cualquier extremo sobresaliente dañado o incompatible del ADN en ADN 5'-fosforilado y de extremo romo, lo que permite la ligación inmediata de extremos romos, mientras que el tratamiento de cola de A agrega una A al extremo 3' del ADN cortado. Las moléculas de ADN con una longitud de 1 kb se seleccionan cargándolas en el gel de PAGE TBE al 6%. En el siguiente paso, las moléculas de ADN se circularizan con oligonucleótidos sintéticos de 30 pb de longitud con cola de T (T30), que contienen dos sitios de reconocimiento MmeI orientados hacia afuera, y el ADN circularizado resultante se somete a replicación en círculo rodante . Las moléculas de ADN circularizadas amplificadas se digieren con MmeI (endonucleasa de restricción tipo IIs), que corta a cierta distancia de su sitio de reconocimiento, liberando el fragmento T30 flanqueado por etiquetas de 17-18 pb (≈70 pb de longitud). Las moléculas con etiquetas apareadas deben repararse en los extremos antes de la ligación de los oligonucleótidos cebadores de ePCR (PCR en emulsión) (FDV2 y RDV2) a ambos extremos. Las moléculas de la biblioteca resultantes de 135 pb se seleccionan por tamaño y se les aplica la traducción de muescas . Finalmente, se amplifican las moléculas de la biblioteca de etiquetas de extremos apareados de 135 pb mediante PCR para aumentar la cantidad de material de la biblioteca y eliminar los productos de ligación extraños en un solo paso. La plantilla de ADN resultante consta de una secuencia FDV de 44 pb, una etiqueta proximal de 17-18 pb, la secuencia T30, una etiqueta distal de 17-18 pb y una secuencia RDV de 25 pb.
Amplificación de plantilla
PCR en emulsión
Las microesferas monocapa recubiertas de estreptavidina paramagnética se cargan previamente con un cebador directo de biotina doble. La estreptavidina tiene una afinidad muy fuerte por la biotina , por lo que el cebador directo se unirá firmemente a la superficie de las microesferas. A continuación, se prepara una fase acuosa con las microesferas precargadas, la mezcla de PCR, los cebadores directo e inverso y la biblioteca de etiquetas de extremos apareados. Esta mezcla se combina y se agita en un vórtex con una fase oleosa para crear la emulsión. Idealmente, cada gota de agua en la emulsión oleosa contiene una microesfera y una molécula de ADN molde, lo que permite millones de amplificaciones no interactivas dentro de un volumen de escala de mililitros mediante PCR.
Ruptura de la emulsión
Tras la amplificación, la emulsión del paso anterior se rompe con isopropanol y tampón detergente (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (p/v) SDS), seguido de una serie de agitaciones en vórtex, centrifugaciones y separación magnética. La solución resultante es una suspensión de microesferas vacías, clonales y no clonales, que provienen de gotas de emulsión que inicialmente contienen cero, una o varias moléculas de ADN molde, respectivamente. La microesfera amplificada puede enriquecerse en el siguiente paso.
Enriquecimiento de cuentas
El enriquecimiento de las microesferas amplificadas se logra mediante hibridación con microesferas de poliestireno no magnéticas, de menor densidad y mayor tamaño, precargadas con oligonucleótidos de captura biotinilados (secuencias de ADN complementarias a la secuencia del amplicón de ePCR). La mezcla se centrifuga para separar el complejo de microesferas amplificadas y de captura de las microesferas no amplificadas. Este complejo, de menor densidad, permanece en el sobrenadante, mientras que las microesferas no amplificadas forman un precipitado. El sobrenadante se recupera y se trata con NaOH, lo que disocia el complejo. Las microesferas amplificadas paramagnéticas se separan de las microesferas de captura no magnéticas mediante separación magnética. Este protocolo de enriquecimiento permite enriquecer las microesferas amplificadas hasta cinco veces.
Remate de cuentas
El objetivo del recubrimiento con perlas es unir un oligonucleótido de recubrimiento al extremo 3' de ambos cebadores de ePCR directos no extendidos y al segmento RDV del ADN molde. El recubrimiento utilizado es un grupo amino que impide que las sondas fluorescentes se unan a estos extremos y, al mismo tiempo, facilita el acoplamiento posterior del ADN molde al cubreobjetos aminosilanizado de la celda de flujo.
Disposición de cubreobjetos
Primero, los cubreobjetos se lavan y se tratan con aminosilano, lo que permite el posterior acoplamiento covalente del ADN molde y elimina cualquier contaminación fluorescente. Las microesferas amplificadas y enriquecidas se mezclan con acrilamida y se vierten en un molde poco profundo formado por un portaobjetos de microscopio recubierto de teflón . Inmediatamente, se coloca el cubreobjetos tratado con aminosilano sobre el gel de acrilamida y se deja polimerizar durante 45 minutos. A continuación, se invierte el conjunto portaobjetos/cubreobjetos y se retira el portaobjetos del gel. Los cubreobjetos tratados con silano se unirán covalentemente al gel, mientras que el teflón en la superficie del portaobjetos facilitará su extracción del gel de acrilamida. Los cubreobjetos se adhieren al cuerpo de la celda de flujo y se eliminan las microesferas no adheridas.
secuenciación de ADN
La bioquímica de la secuenciación de Polony se basa principalmente en la capacidad discriminatoria de las ligasas y polimerasas. Primero, una serie de cebadores de anclaje se introducen en las células y se hibridan con las secuencias de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 3' o 5' inmediato de las etiquetas de ADN genómico proximales o distales de 17-18 pb. A continuación, se realiza una reacción de ligación enzimática del cebador de anclaje a una población de nonámeros desgenerados marcados con colorantes fluorescentes. Nonámeros marcados diferencialmente:
5' Cy5‐NNNNNNNNT 5' Cy3‐NNNNNNNNA 5' TexasRed‐NNNNNNNNC 5' 6FAM‐NNNNNNNNG
Los nonámeros marcados con fluoróforo se hibridan con éxito diferencial a las secuencias de la etiqueta según una estrategia similar a la de los cebadores degenerados , pero en lugar de someterse a polimerasas, los nonámeros se ligan selectivamente al ADN adyacente: el cebador de anclaje. La fijación de la molécula de fluoróforo proporciona una señal fluorescente que indica si hay una A, C, G o T en la posición de consulta en la etiqueta de ADN genómico. Después de la obtención de imágenes de cuatro colores, los complejos cebador de anclaje/nonámero se eliminan y se inicia un nuevo ciclo reemplazando el cebador de anclaje. Se introduce una nueva mezcla de nonámeros marcados con fluorescencia, para la cual la posición de consulta se desplaza una base más hacia el interior de la etiqueta de ADN genómico.
5' Cy5‐NNNNNNNTN 5' Cy3‐NNNNNNNAN 5' TexasRed‐NNNNNNNCN 5' 6FAM‐NNNNNNNGN
De esta forma, se podrían consultar siete bases desde la dirección 5' a 3' y seis bases desde el extremo 3'. El resultado final es una longitud de lectura de 26 bases por ejecución (13 bases de cada una de las etiquetas emparejadas) con un espacio de 4 a 5 bases en el medio de cada etiqueta.
Análisis y software
La secuenciación de polonia genera millones de lecturas de 26 bits por corrida, y esta información debe normalizarse y convertirse en secuencia. Esto se puede realizar con el software desarrollado por Church Lab. Todo el software es gratuito y se puede descargar desde el sitio web. [ 1 ]
Instrumentos
El instrumento de secuenciación utilizado en esta técnica podría configurarse con un microscopio de fluorescencia común y una celda de flujo controlada por computadora. Los instrumentos necesarios costaban alrededor de US$130,000 en 2005. Una máquina de secuenciación de polonias dedicada, Polonator , fue desarrollada en 2009 y vendida por Dover a US$170,000 . [ 2 ] [ 3 ] Contaba con software, reactivos y protocolos de código abierto y estaba destinada a ser utilizada en el Proyecto Genoma Personal . [ 4 ]
Fortalezas y debilidades
La secuenciación de polonias permite una alta productividad y una elevada precisión de secuenciación de ADN mediante un instrumento económico y de fácil acceso. Además, es una técnica muy flexible que posibilita diversas aplicaciones, como la resecuenciación de BAC (cromosomas artificiales bacterianos) y genomas bacterianos, así como la secuenciación de etiquetas y códigos de barras SAGE (análisis serial de la expresión génica). Asimismo, la técnica de secuenciación de polonias se caracteriza por ser un sistema abierto que comparte todos sus componentes, incluyendo el software desarrollado, el protocolo y los reactivos.
Sin embargo, aunque la adquisición de datos brutos puede alcanzar hasta 786 gigabits, solo 1 bit de información de cada 10 000 bits recopilados resulta útil. Otro desafío de esta técnica es la uniformidad de la amplificación relativa de los objetivos individuales. La amplificación no uniforme puede reducir la eficiencia de la secuenciación y constituye el principal obstáculo de esta técnica.
Historia
La secuenciación de polonias es un desarrollo de la tecnología de polonias de finales de los años 90 y 2000. [ 5 ] En 2003 se desarrollaron métodos para secuenciar polonias in situ utilizando extensión de una sola base que podía lograr lecturas de 5-6 bases. [ 6 ] Para 2005, estos primeros intentos se habían revisado para desarrollar la tecnología de secuenciación de polonias existente. [ 7 ] Los conceptos de secuenciación por ligación altamente paralela de la secuenciación de polonias han contribuido a la base de tecnologías de secuenciación posteriores como ABI Solid Sequencing .
Referencias
- ↑ "Secuenciación de código abierto" . arep.med.harvard.edu . Consultado el 17 de septiembre de 2017 .
- ↑ "Tras la fase de acceso anticipado, Polonator actualizado está listo para su lanzamiento con un precio de 170 000 dólares" . GenomeWeb . 5 de mayo de 2009. Consultado el 17 de septiembre de 2017 .
- ↑ "El Polonator de Dover no se ve afectado por la reestructuración de Danaher, según un funcionario" . GenomeWeb . 8 de septiembre de 2009. Consultado el 17 de septiembre de 2017 .
- ↑ "El Polonator" . 3 de abril de 2015. Archivado del original el 3 de abril de 2015. Consultado el 17 de septiembre de 2017 .
- ↑ Adessi, C.; Matton, G.; Ayala, G.; Turcatti, G.; Mermod, JJ; Mayer, P.; Kawashima, E. (2000-10-15). "Amplificación de ADN en fase sólida: caracterización de la unión del cebador y los mecanismos de amplificación" . Nucleic Acids Research . 28 (20): E87. doi : 10.1093/nar/28.20.e87 . ISSN 1362-4962 . PMC 110803. PMID 11024189 .
- ↑ Shendure, Jay; Porreca, Gregory J.; Reppas, Nikos B.; Lin, Xiaoxia; McCutcheon, John P.; Rosenbaum, Abraham M.; Wang, Michael D.; Zhang, Kun; Mitra, Robi D. (2005-09-09). "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome" . Science . 309 (5741): 1728– 1732. Bibcode : 2005Sci...309.1728S . doi : 10.1126/science.1117389 . ISSN 0036-8075 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .
- ↑ Shendure, Jay; Porreca, Gregory J.; Reppas, Nikos B.; Lin, Xiaoxia; McCutcheon, John P.; Rosenbaum, Abraham M.; Wang, Michael D.; Zhang, Kun; Mitra, Robi D. (2005-09-09). "Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome" . Science . 309 (5741): 1728– 1732. Bibcode : 2005Sci...309.1728S . doi : 10.1126/science.1117389 . ISSN 0036-8075 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .
Enlaces externos
- "Secuenciación de ultrabajo coste" . Tecnologías Moleculares de Harvard.
- "El Polonator" . Dover Systems. Archivado del original el 21 de mayo de 2013.
- métodos de secuenciación de ADN
- Técnicas genéticas