Rebanadas de pulmón cortadas con precisión

Los pasos básicos involucrados en la preparación de PCLS utilizando vibrátomos incluyen: ^{[ 8 ]}

Selección de tejidos

Comience seleccionando cuidadosamente el tejido pulmonar de la especie deseada, como roedores o humanos, asegurándose de que el tejido sea de alta calidad y esté sano.

Inclusión de tejidos

Para facilitar el corte y mantener la estructura del tejido, este se suele incrustar en un medio adecuado, como agarosa o gelatina, en el soporte de muestras del vibrátomo.

Proceso de corte

El vibrátomo funciona mediante la oscilación vertical u horizontal de una cuchilla a altas frecuencias mientras el tejido se encuentra sumergido en una solución de corte. Esta oscilación mecánica crea cortes finos y precisos de tejido pulmonar. Los investigadores pueden ajustar los parámetros de corte, como el grosor de los cortes, para cumplir con los requisitos experimentales específicos. Por lo general, los cortes de tejido pulmonar tienen un grosor que oscila entre 200 y 500  μm.

Procesamiento posterior

Dependiendo de los objetivos de la investigación, las muestras de tejido cerebral primario (PCLS) pueden someterse a pasos adicionales como lavado, cultivo o tratamiento con sustancias de interés, como fármacos o estímulos.

Garantizar la viabilidad de las secciones de pulmón de precisión (PCLS) durante el mantenimiento ex vivo presenta varios desafíos. Normalmente, las PCLS se sumergen en medio de cultivo en placas de múltiples pocillos, simulando las condiciones de cultivo de tejidos a 37  °C, 5 % de CO₂ _y 95-100 % de humedad del aire. ^{[ 9 ]} El medio de cultivo se renueva diariamente y se optimiza con nutrientes esenciales, lo que permite mantener las PCLS viables hasta por 14 días, una mejora significativa en comparación con informes anteriores de solo 3-5 días. ^{[ 10 ]} Además, la inclusión de antibióticos como la penicilina y la estreptomicina ayuda a prevenir la contaminación por patógenos desde el inicio del cultivo. ^{[ 11 ]}

Durante el cultivo, las PCLS conservan su viabilidad, actividad metabólica normal, integridad tisular y capacidad de respuesta a estímulos como el lipopolisacárido (LPS). ^{[ 10 ]} Sin embargo, es importante señalar que los periodos de cultivo prolongados pueden provocar algunos cambios en la función de las PCLS. Por ejemplo, aunque las PCLS humanas pueden contraerse en respuesta a la metacolina, la secreción de TNF-α inducida por LPS, si bien se mantiene, puede disminuir con el tiempo. ^{[ 12 ]} Además, el cultivo a largo plazo puede resultar en la pérdida de ciertas poblaciones celulares, como neumocitos y linfocitos, así como en la degradación de las fibras del tejido conectivo. Estos cambios pueden contribuir a una menor sensibilidad de las PCLS cultivadas a los estímulos externos. ^{[ 12 ]}

En la práctica, los PCLS pueden mantener una viabilidad y homeostasis tisular comparables durante 1 a 3 días, aunque se pueden lograr períodos más prolongados con condiciones de cultivo optimizadas. ^{[ 13 ]}

En la búsqueda por comprender y desarrollar tratamientos para el asma, los investigadores han explorado diversos modelos, incluidos modelos animales como ratones y ratas, para imitar diferentes aspectos de la enfermedad. Si bien estos modelos animales han contribuido a nuestro conocimiento, presentan limitaciones, particularmente en términos de aplicabilidad a los humanos. ^{[ 14 ]}

Para abordar estas limitaciones y mejorar nuestra comprensión del asma, los investigadores han recurrido a cortes de pulmón de precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) humanos, obtenidos tanto de individuos sanos como enfermos, como una valiosa herramienta ex vivo. ^{[ 15 ]} Los PCLS derivados de pulmones sanos y asmáticos exhiben respuestas alteradas a diversos estímulos, incluyendo broncoconstricción e hiperreactividad, que se asemejan mucho a las observadas en pacientes y diversos modelos animales. ^{[ 15 ]}

Además, se ha demostrado que los PCLS de individuos con asma presentan una inflamación de las vías respiratorias y una hiperreactividad significativamente mayores cuando se estimulan con factores como el rinovirus. ^{[ 16 ]} Estos PCLS también exhiben una expresión génica elevada relacionada con la patogénesis del asma, incluyendo genes como Il25, Tslp e Il13. ^{[ 17 ]} Estos hallazgos coinciden con las observaciones en pacientes asmáticos, lo que indica que los modelos de PCLS proporcionan una plataforma prometedora para la investigación del asma. ^{[ 15 ]}

Si bien ningún modelo in vivo abarca por completo todos los aspectos de la patología clínica de la EPOC, ciertos modelos animales, como los que implican la exposición al humo del cigarrillo, el enfisema inducido por elastasa y la administración de LPS, han proporcionado información valiosa. Por ejemplo, la exposición de cobayas o ratones al humo del cigarrillo puede reproducir características clave de la EPOC humana, como el enfisema, la remodelación de las vías respiratorias pequeñas y la hipertensión pulmonar. Sin embargo, este modelo suele manifestar un enfisema leve y requiere meses para desarrollarse. ^{[ 18 ]} En cambio, la administración de elastasa a los pulmones de ratones induce rápidamente un fenotipo enfisematoso, lo que permite controlar la gravedad de la enfermedad ajustando la dosis, la vía de administración y la duración del tratamiento con elastasa. ^{[ 19 ]} Cabe destacar que la relevancia fisiológica de los modelos de elastasa y LPS es discutible debido a las diferencias en los mecanismos subyacentes. ^{[ 20 ]}

El uso de cortes de pulmón de precisión (PCLS) de modelos in vivo ha demostrado ser particularmente valioso para modelar la EPOC. Por ejemplo, los PCLS obtenidos de ratones expuestos al humo han mostrado una expresión elevada de quimiocinas al ser estimulados con imitadores virales o el virus de la influenza A. ^{[ 21 ]} Los PCLS murinos también han demostrado que la infección por influenza A y el humo del cigarrillo pueden afectar la respuesta broncodilatadora a los agonistas de los receptores β2-adrenérgicos. Los estudios futuros que empleen PCLS de pacientes con EPOC tienen el potencial de permitir la caracterización funcional y fenotípica de las células inmunitarias, facilitando una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad de la enfermedad.

Las secciones de tejido pulmonar de precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) han demostrado ser eficaces para estudiar las etapas iniciales de la fibrosis pulmonar en la FPI. Al exponerse a TGF-β1 y cloruro de cadmio, tanto las PCLS humanas como las de rata han mostrado cambios histopatológicos relevantes, comúnmente observados en las fases iniciales de la fibrosis pulmonar. Estos cambios incluyen la sobreexpresión de genes profibróticos clave, el aumento del grosor de los septos alveolares y la activación anormal de las células pulmonares. ^{[ 22 ]}

Los recientes avances en la investigación han llevado al establecimiento de un modelo ex vivo de PCLS humano específicamente enfocado en la fibrosis en etapa temprana. Este modelo implica la exposición de PCLS a una combinación de factores de crecimiento profibróticos y moléculas de señalización, incluyendo TGF-β1, TNF-α, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB y ácido lisofosfatídico. ^{[ 23 ]} Este enfoque ofrece una vía para investigar los mecanismos subyacentes de la FPI temprana y evaluar nuevas terapias. ^{[ 24 ]}

Los investigadores están evaluando activamente nuevos tratamientos para la FPI utilizando PCLS. Por ejemplo, la cafeína, que inhibe el aumento de la expresión génica profibrótica inducido por TGF-β, ha demostrado ser prometedora al reducir significativamente la fibrosis en PCLS de ratones tratados con bleomicina. Además, la modulación de la señalización de PI3K ha surgido como una estrategia de tratamiento antifibrótico prometedora, como se ha demostrado utilizando PCLS derivados de pacientes con FPI. ^{[ 24 ]}

El uso de PCLS en la investigación de la FPI tiene un gran potencial para comprender las etapas iniciales de la enfermedad, probar terapias innovadoras y descubrir nuevas estrategias de tratamiento.

Las secciones de pulmón cortadas con precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) han sido fundamentales para estudiar las respuestas innatas del organismo a las infecciones virales y, en menor medida, bacterianas. Este sistema ha permitido dilucidar qué células se infectan dentro del pulmón intacto, ofreciendo información distinta a la de los cultivos in vitro en interfase aire-líquido. ^{[ 25 ]}

Estudios realizados por Goris et al. han revelado variaciones en la infectividad de diferentes tipos de células dentro del pulmón. Por ejemplo, la infección por el virus de la parainfluenza bovina se observó principalmente en células debajo del epitelio pulmonar dentro del sistema PCLS. ^{[ 26 ] [ 27 ]} Es importante destacar que esto sugiere que el epitelio, cuando se encuentra en su estructura fisiológica natural, resiste la infección. Kirchhoff et al. informaron hallazgos similares. ^{[ 28 ]} Estos estudios enfatizan la importancia de estudiar las células dentro de su entorno fisiológico, considerando las asociaciones celulares y la arquitectura estructural. Dichas interacciones no solo afectan la infectividad, sino que también dan forma a la respuesta del sistema a la infección.

El sistema PCLS constituye una valiosa herramienta para comprender las respuestas inflamatorias. Se ha empleado para investigar la respuesta innata a componentes de la pared bacteriana como el LPS y para realizar estudios complejos de infecciones mixtas que involucran múltiples virus o coinfecciones virales y bacterianas. Este enfoque permite un análisis preciso de las respuestas inmunitarias a cada estímulo. En modelos más simples, el PCLS se ha utilizado para evaluar el impacto del LPS en la respuesta inmunitaria innata, probando los efectos de diversos inmunomoduladores en la señalización innata. ^{[ 29 ] [ 23 ]}

Además, la posibilidad de obtener muestras de pulmones enfermos, como los afectados por afecciones como la EPOC y el asma, proporciona un modelo sólido para estudiar cómo las enfermedades respiratorias influyen en la infectividad y las respuestas del huésped. Esto es particularmente relevante para enfermedades como la EPOC y el asma, que están relacionadas con exacerbaciones inducidas por patógenos.

La investigación del PCLS en el campo de la infección y la inflamación mejora nuestra comprensión de las respuestas inmunitarias, allanando el camino para obtener información sobre los mecanismos de las enfermedades y las posibles estrategias terapéuticas.

Las secciones de tejido pulmonar cortadas con precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel crucial en la evaluación de nuevas dianas terapéuticas para el asma, especialmente a medida que aumenta la tolerancia a los tratamientos convencionales como los glucocorticoides y los agonistas del receptor β2. Los investigadores se han centrado cada vez más en dianas relevantes para la patogénesis del asma, y ​​las PCLS se han convertido en una valiosa herramienta para evaluar estas dianas como posibles tratamientos. ^{[ 30 ]}

Por ejemplo, estudios han demostrado que la inhibición de la histona deacetilasa con tricostatina A puede aliviar la constricción de las vías respiratorias en PCLS humanas y, simultáneamente, reducir la hiperreactividad de las vías respiratorias en ratones expuestos a antígenos. ^{[ 31 ]} Además, se ha descubierto que la activación de la guanilato ciclasa soluble en el músculo liso de las vías respiratorias mediante análogos de riociguat y cinaciguat induce broncodilatación en PCLS humanas normales y revierte la hiperreactividad de las vías respiratorias en ratones asmáticos alérgicos, restaurando la función pulmonar normal. ^{[ 30 ] [ 32 ]}

El uso de PCLS en el desarrollo de fármacos se está expandiendo aún más, y en este contexto se están investigando agonistas o inhibidores específicos dirigidos a los receptores del sabor amargo, el receptor activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR) γ, la fosfoinositida-3 quinasa (PI3K), los canales BK y la tirosina quinasa del bazo (Syk). ^{[ 30 ] [ 33 ]}

La investigación de PCLS contribuye significativamente al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para el asma, abordando los desafíos cambiantes de la resistencia al tratamiento. ^{[ 30 ]}