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Cromatografía de capa fina

La cromatografía de capa fina ( TLC ) es una técnica cromatográfica que separa componentes en mezclas no volátiles. [ 1 ] Se realiza en una placa de TLC compuesta por un sólido ...

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La cromatografía de capa fina ( TLC ) es una técnica cromatográfica que separa componentes en mezclas no volátiles. [ 1 ]

Se realiza en una placa de TLC compuesta por un sólido no reactivo recubierto con una fina capa de material adsorbente . [ 2 ] Esto se denomina fase estacionaria. [ 2 ] La muestra se deposita en la placa, que se eluye con un disolvente o mezcla de disolventes conocido como fase móvil (o eluyente ). [ 3 ] Este disolvente se mueve hacia arriba en la placa por acción capilar . [ 4 ] Como en toda cromatografía , algunos compuestos son más atraídos por la fase móvil, mientras que otros lo son por la fase estacionaria. [ 5 ] Por lo tanto, los diferentes compuestos se mueven hacia arriba en la placa de TLC a diferentes velocidades y se separan. [ 6 ] Para visualizar los compuestos incoloros, la placa se observa bajo luz UV o se tiñe. [ 7 ] A menudo es necesario probar diferentes fases estacionarias y móviles para obtener manchas bien definidas y separadas.

La TLC es rápida, sencilla y ofrece alta sensibilidad a un costo relativamente bajo. [ 5 ] Puede monitorear el progreso de la reacción, identificar compuestos en una mezcla, determinar la pureza o purificar pequeñas cantidades de un compuesto. [ 5 ]

Procedimiento

El proceso de TLC es similar a la cromatografía en papel, pero ofrece corridas más rápidas, mejores separaciones y la posibilidad de elegir entre diferentes fases estacionarias. [ 5 ] Las placas se pueden etiquetar antes o después del proceso de cromatografía con un lápiz u otro instrumento que no interfiera con el proceso. [ 8 ]

Hay cuatro etapas principales para ejecutar una placa de cromatografía de capa fina: [ 3 ] [ 8 ]

Preparación de la placa: Utilizando un tubo capilar, se deposita una pequeña cantidad de una solución concentrada de la muestra cerca del borde inferior de una placa de cromatografía de capa fina (TLC). Se deja que el disolvente se evapore por completo antes de continuar. Para disolventes no volátiles, puede ser necesaria una cámara de vacío . El procedimiento de aplicación puede repetirse para asegurar la cantidad suficiente de compuesto y obtener un resultado visible. Según la aplicación, se pueden colocar varias muestras en fila, a la misma distancia del borde inferior; cada muestra se desplazará por la placa en su propio carril.

Cromatografía en capa fina de tres aminoácidos y una muestra (izquierda) con traducción al inglés (derecha).

Preparación de la cámara de revelado: El disolvente o la mezcla de disolventes se coloca en un recipiente transparente (cámara de separación/revelado) hasta una profundidad inferior a 1 centímetro. Se coloca una tira de papel de filtro (también llamada "mecha") a lo largo de la pared del recipiente. Este papel de filtro debe tocar el disolvente y casi llegar al borde superior del recipiente. Se cubre el recipiente con una tapa y se deja que los vapores del disolvente saturen la atmósfera del recipiente. Si no se sigue este procedimiento, la separación será deficiente y los resultados no serán reproducibles.

Desarrollo: La placa de TLC se coloca en el recipiente de manera que la(s) mancha(s) de muestra no queden sumergidas en la fase móvil. El recipiente se tapa para evitar la evaporación del disolvente. El disolvente migra hacia arriba por la placa por acción capilar , se encuentra con la mezcla de muestra y la transporta hacia arriba (eluye la muestra). La placa se retira del recipiente antes de que el disolvente alcance la parte superior de la placa; de lo contrario, los resultados serán erróneos. Se marca el frente del disolvente , la marca más alta que ha alcanzado el disolvente a lo largo de la placa.

Visualización: El solvente se evapora de la placa. Los métodos de visualización incluyen luz ultravioleta, tinción y muchos más.

Proceso y principio de separación

La separación de compuestos se debe a las diferencias en su atracción hacia la fase estacionaria y a las diferencias en su solubilidad en el disolvente. [ 9 ] Los distintos compuestos de la mezcla de muestra se desplazan a diferentes velocidades debido a las diferencias en sus coeficientes de partición . [ 10 ] Los distintos disolventes, o las distintas mezclas de disolventes, dan lugar a diferentes separaciones. [ 5 ] El factor de retardo ( R F ) cuantifica los resultados. Es la distancia recorrida por una sustancia dada dividida por la distancia recorrida por la fase móvil.

Desarrollo de una placa de cromatografía en capa fina (TLC). Las manchas que aparecen de color púrpura se separan en manchas rojas y manchas azules.

En la cromatografía de capa fina (TLC ) de fase normal , la fase estacionaria es polar . El gel de sílice es muy común en la TLC de fase normal. Los compuestos más polares en una mezcla de muestra interactúan más fuertemente con la fase estacionaria polar. Como resultado, los compuestos más polares se mueven menos (lo que resulta en un R F menor ), mientras que los compuestos menos polares se mueven más arriba en la placa ( R F mayor ). [ 10 ] Una fase móvil más polar disuelve más los compuestos polares. [ 10 ] Por lo tanto, todos los compuestos en la placa de TLC se mueven más arriba en la placa en mezclas de solventes polares. Los solventes "fuertes" mueven los compuestos más arriba en la placa, mientras que los solventes "débiles" los mueven menos. [ 11 ]

Si la fase estacionaria es no polar, como las placas de sílice funcionalizadas con C18 , se denomina cromatografía en capa fina de fase inversa . En este caso, los compuestos no polares se desplazan menos y los compuestos polares se desplazan más. La mezcla de disolventes también será mucho más polar que en la cromatografía en capa fina de fase normal. [ 11 ]

Elección del disolvente

Una serie eluotrópica , que ordena los disolventes según su capacidad de desplazamiento de compuestos, puede ayudar a seleccionar una fase móvil. [ 5 ] Los disolventes se dividen en grupos de selectividad. [ 5 ] [ 12 ] El uso de disolventes con diferentes fuerzas de elución o diferentes grupos de selectividad a menudo puede dar resultados muy diferentes. [ 5 ] [ 12 ] Si bien las fases móviles de un solo disolvente a veces pueden proporcionar una buena separación, en algunos casos pueden requerirse mezclas de disolventes. [ 13 ]

En la cromatografía en capa fina de fase normal, las mezclas de disolventes más comunes incluyen acetato de etilo/hexano ( EtOAc / Hex ) para compuestos menos polares y metanol/diclorometano ( MeOH / DCM ) para compuestos más polares. [ 14 ] Diferentes mezclas y proporciones de disolventes pueden ayudar a obtener una mejor separación. [ 15 ] En la cromatografía en capa fina de fase inversa, las mezclas de disolventes suelen ser agua con un disolvente menos polar: las opciones típicas son agua con tetrahidrofurano ( THF ), acetonitrilo ( ACN ) o metanol. [ 14 ]

Análisis

Placa de cromatografía de capa fina visualizada con luz ultravioleta.

Dado que las sustancias químicas que se separan pueden ser incoloras, existen varios métodos para visualizar las manchas:

  • Al colocar la placa bajo luz negra (  luz de 366 nm), los compuestos fluorescentes emiten luz.
  • Las placas de TLC que contienen una pequeña cantidad de un compuesto fluorescente (generalmente silicato de zinc activado con manganeso ) en la capa adsorbente permiten visualizar algunos compuestos bajo luz UV-C (254 nm). La capa adsorbente emitirá fluorescencia verde claro, mientras que las manchas que contienen compuestos que absorben luz UV-C no lo harán. [ 4 ] 
  • Al colocar la placa en un recipiente lleno de vapores de yodo , las manchas se tiñen temporalmente. [ 4 ] Por lo general, adquieren un color amarillo o marrón.
  • La placa de TLC se puede sumergir o rociar con un colorante y, a veces, calentar según el colorante utilizado. Existen muchos colorantes para una amplia gama de grupos químicos, pero algunos ejemplos incluyen: [ 7 ] [ 16 ] [ 17 ]
  • En el caso de los lípidos, el cromatograma puede transferirse a una membrana de fluoruro de polivinilideno y luego someterse a un análisis adicional, por ejemplo, espectrometría de masas . Esta técnica se conoce como transferencia Far-Eastern . [ 4 ]

Producción de placas

Las placas de TLC suelen estar disponibles comercialmente, con rangos de tamaño de partícula estándar para mejorar la reproducibilidad . [ 4 ] Se preparan mezclando el adsorbente, como el gel de sílice , con una pequeña cantidad de aglutinante inerte como el sulfato de calcio (yeso) y agua. [ 18 ] Esta mezcla se extiende como una suspensión espesa sobre una lámina portadora no reactiva, generalmente vidrio , papel de aluminio grueso o plástico. La placa resultante se seca y activa calentándola en un horno durante treinta minutos a 110  °C. [ 18 ] El espesor de la capa absorbente suele ser de alrededor de 0,1–0,25  mm para fines analíticos y de alrededor de 0,5–2,0  mm para TLC preparativa. [ 19 ] Otros recubrimientos adsorbentes incluyen óxido de aluminio (alúmina) o celulosa . [ 18 ]

Aplicaciones

Monitorización y caracterización de la reacción

La TLC es una herramienta valiosa para el monitoreo de reacciones. [ 15 ] Para esto, la placa normalmente contiene una mancha de material de partida, una mancha de la mezcla de reacción y una mancha cruzada (o co-mancha) que contiene ambas. [ 4 ] [ 14 ] El análisis mostrará si el material de partida desapareció y si aparecieron nuevos productos. [ 14 ] Esto proporciona una forma rápida y sencilla de estimar hasta qué punto ha avanzado una reacción. En un estudio, la TLC se ha aplicado para analizar reacciones orgánicas . [ 20 ] Los investigadores hacen reaccionar un alcohol y un catalizador directamente en la co-mancha de una placa de TLC antes de revelarla. Esto proporciona pruebas rápidas y sencillas a pequeña escala de diferentes reactivos .

Cromatografía en capa fina (TLC) para el seguimiento de la reacción y la selección de una mezcla de disolventes de purificación (izquierda) Cromatografía en capa fina (TLC) obtenida mediante cromatografía en columna rápida (derecha)

También es posible la caracterización de compuestos mediante TLC [ 21 ] , similar al monitoreo de reacciones. Sin embargo, en lugar de aplicar el material de partida y la mezcla de reacción, se aplica un compuesto desconocido y uno conocido. Podrían ser el mismo compuesto si ambas manchas tienen el mismo valor de Rf y se ven igual bajo el método de visualización elegido. [ 21 ] No obstante, la coelución complica tanto el monitoreo de reacciones como la caracterización. Esto se debe a que diferentes compuestos se desplazarán a la misma mancha en la placa. En tales casos, diferentes mezclas de solventes pueden proporcionar una mejor separación. [ 22 ]

Pureza y purificación

La TLC ayuda a demostrar la pureza de una muestra. Una muestra pura debería contener solo una mancha en la TLC. La TLC también es útil para la purificación a pequeña escala. [ 23 ] Dado que los compuestos separados estarán en diferentes áreas de la placa, un científico puede raspar las partículas de la fase estacionaria que contienen el compuesto deseado y disolverlas en un solvente apropiado. [ 23 ] Una vez que todo el compuesto se disuelve en el solvente, se filtran las partículas de sílice y luego se evapora el solvente para aislar el producto. Las placas de TLC preparativas grandes con recubrimientos gruesos de gel de sílice pueden separar más de 100 mg de material. [ 23 ] 

La TLC es útil para la purificación y el aislamiento a gran escala para probar rápidamente mezclas de solventes antes de realizar cromatografía en columna rápida en un lote grande de material impuro. [ 13 ] [ 24 ] Un compuesto eluye de una columna cuando la cantidad de solvente recolectado es igual a 1/ R F . [ 25 ] El eluyente de la cromatografía en columna rápida se recolecta en varios recipientes (por ejemplo, tubos de ensayo) llamados fracciones. La TLC ayuda a mostrar qué fracciones contienen impurezas y cuáles contienen el compuesto puro.

Además, la cromatografía en capa fina bidimensional (TLC bidimensional ) [ 4 ] puede ayudar a comprobar si un compuesto es estable en una fase estacionaria específica. Esta prueba requiere dos corridas en una placa de TLC cuadrada. La placa se gira 90º antes de la segunda corrida. Si el compuesto de interés aparece en la diagonal del cuadrado, es estable en la fase estacionaria elegida. De lo contrario, se está descomponiendo en la placa. En este caso, una fase estacionaria alternativa podría prevenir dicha descomposición. [ 26 ]

La TLC es también un método analítico para la separación directa de enantiómeros y el control de la pureza enantiomérica, por ejemplo, de principios activos farmacéuticos ( API ) que son quirales. [ 27 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Harry W. Lewis y Christopher J. Moody (13 de junio de 1989). Química orgánica experimental: principios y práctica (  edición ilustrada). WileyBlackwell. págs. 159-173 . ISBN  9780632020171.
  2. 1 2 Zhang, Meizhen; Yu, Qian; Guo, Jiaqi; Wu, Bo; Kong, Xianming (2022-11-28). "Revisión de la cromatografía de capa fina en tándem con espectroscopia Raman mejorada en superficie para la detección de analitos en muestras mixtas" . Biosensors . 12 ( 11): 937. doi : 10.3390/bios12110937 . ISSN 2079-6374 . PMC 9687685. PMID 36354446 .   
  3. 1 2 Silver, Jack (2020-12-08). "¡Enseñemos la técnica adecuada de cromatografía de capa fina!" . Journal of Chemical Education . 97 (12): 4217– 4219. Bibcode : 2020JChEd..97.4217S . doi : 10.1021/acs.jchemed.0c00437 . ISSN 0021-9584 . S2CID 226349471 .  
  4. 1 2 3 4 5 6 7 Stahl, Egon (1969), "Aparatos y técnicas generales en TLC" , en Stahl, Egon (ed.), Cromatografía de capa fina: Manual de laboratorio , Berlín, Heidelberg: Springer, pp. 52–86 , doi : 10.1007/978-3-642-88488-7_3 , ISBN  978-3-642-88488-7, consultado el 29 de marzo de 2023
  5. 1 2 3 4 5 6 7 8 Santiago, Marina; Strobel, Scott (2013-01-01), "Capítulo veinticuatro - Cromatografía de capa fina", en Lorsch, Jon (ed.), Célula, lípidos y carbohidratos , Métodos en enzimología, vol. 533, Academic Press, pp. 303–324 , doi : 10.1016/b978-0-12-420067-8.00024-6 , ISBN   978-0-12-420067-8, PMID 24182936 , consultado el 29-03-2023 
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Bibliografía

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  • Justus G. Kirchner (1978): Cromatografía de capa fina, 2.ª edición, Wiley
  • Joseph Sherma, Bernard Fried (1991): Manual de cromatografía en capa fina (= Ciencia cromatográfica. Bd. 55). Marcel Dekker, Nueva York NY, ISBN 0-8247-8335-2.
  • Elke Hahn-Deinstorp: Cromatografía de capa fina aplicada. Buenas prácticas y prevención de errores. Wiley-VCH, Weinheim ua 2000, ISBN 3-527-29839-8