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Descripción general de la extensión del cebador. El transcrito de interés tiene uracilo en +1 (desconocido antes del ensayo). 2) Sintetizar un cebador marcado en el extremo 5' (usando [γ32P] ATP). 3) Generar ADNc extendiendo el cebador con transcriptasa inversa hasta el extremo 5' del transcrito. 4) El resultado es un ADNc con cebador extendido marcado radiactivamente, que se desnaturaliza y se separa en un gel de poliacrilamida, detectándose mediante autorradiografía. Normalmente, en el gel también se encuentra una escalera de secuenciación con el mismo cebador, lo que permite la identificación rápida del nucleótido +1 (mostrado en púrpura).

La extensión de cebadores es una técnica que permite mapear los extremos 5' del ARN , es decir, secuenciarlos e identificarlos correctamente.

La extensión del cebador se puede utilizar para determinar el sitio de inicio de la transcripción (el sitio final no se puede determinar con este método) a partir de cuya secuencia se conoce. Esta técnica requiere un cebador radiomarcado (generalmente de 20 a 50 nucleótidos de longitud) que sea complementario a una región cercana al extremo 3' del ARNm. Se permite que el cebador se hibride con el ARN y se utiliza transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir del ARN hasta que alcanza el extremo 5' del ARN. Al desnaturalizar el híbrido y utilizar el ADNc del cebador extendido como marcador en un gel electroforético, es posible determinar el sitio de inicio de la transcripción . Esto generalmente se hace comparando su ubicación en el gel con la secuencia de ADN (por ejemplo, secuenciación de Sanger ), preferiblemente utilizando el mismo cebador en la hebra molde de ADN. El nucleótido exacto en el que comienza la transcripción se puede determinar comparando el cebador extendido marcado con el nucleótido marcador, ya que ambos comparten la misma distancia de migración en el gel.

La extensión de cebadores ofrece una alternativa al ensayo de protección con nucleasas (mapeo con nucleasa S1) para cuantificar y mapear transcritos de ARN. La sonda de hibridación para la extensión de cebadores es un oligonucleótido sintetizado, mientras que el mapeo con S1 requiere el aislamiento de un fragmento de ADN. Ambos métodos proporcionan información sobre el inicio del ARNm y permiten estimar la concentración del transcrito según la intensidad de la banda correspondiente en la autorradiografía resultante. Sin embargo, a diferencia del mapeo con S1, la extensión de cebadores solo permite localizar el extremo 5' de un transcrito de ARNm, ya que la síntesis de ADN necesaria para el ensayo depende de la transcriptasa inversa (que solo polimeriza en la dirección 5' → 3').

La extensión del cebador no se ve afectada por los sitios de empalme y, por lo tanto, es preferible en situaciones donde los sitios de empalme intermedios impiden el mapeo S1. Finalmente, la extensión del cebador es más precisa que el mapeo S1 porque la nucleasa S1 utilizada en este último puede "roer" los extremos del híbrido ARN-ADN o no degradar completamente las regiones monocatenarias, lo que hace que un transcrito parezca más corto o más largo.

Referencias

  • https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/primer-extension
  • Shenk, TE, C. Rhodes, PWJ Rigby y P. Berg. “Procedimiento bioquímico para la producción de pequeñas deleciones en el ADN del virus simio 40”. Actas de la Academia Nacional de Ciencias 72.4 (1975): 1392-396. Impreso.