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El análisis de marcaje y seguimiento (PCA) se utiliza para estudiar los ciclos de vida de las proteínas. Los experimentos de análisis de marcaje y seguimiento emplean marcadores radiactivos y citotóxicos para "etiquetar" las proteínas. Los métodos más comunes incluyen el tratamiento de las células con cicloheximida (CHX) para detener la síntesis de proteínas o el uso de aminoácidos o proteínas radioisotópicas, como la proteína verde fluorescente (GFP) . Estos marcadores se utilizan para estudiar las proteínas a lo largo de sus ciclos de vida. [ 1 ]
Si bien el análisis de marcaje y seguimiento se utiliza principalmente para estudiar proteínas, también puede emplearse para estudiar diferentes estructuras moleculares que interactúan con ellas. Las proteínas pueden interactuar con distintas estructuras, ya sea porque se incorporan a ellas, como en las células, o porque forman parte de una estructura mayor, como en las macromoléculas.
En bioquímica y biología molecular , un análisis de pulso-caza es un método para examinar un proceso celular que ocurre a lo largo del tiempo mediante la exposición sucesiva de las células a un compuesto marcado (pulso) y luego al mismo compuesto en forma no marcada (caza). [ 2 ]
Mecanismo
Los experimentos de marcaje y seguimiento se dividen en dos partes: un "pulso" y un "seguimiento". En la fase de "pulso", el proteoma de las células se marca con aminoácidos radiactivos . En la fase de "seguimiento", se impide que las células absorban aminoácidos.
Para iniciar un experimento de marcaje y seguimiento, las células se cultivan en presencia de aminoácidos radiactivos. Esto se hace para que las células incorporen los aminoácidos a sus proteomas. Cuando los investigadores desean estudiar la síntesis de proteínas (por ejemplo, el plegamiento, el transporte y la degradación), inician la fase de seguimiento del experimento. Para ello, las células se exponen a isótopos de aminoácidos no radiactivos para detener la incorporación de isótopos radiactivos. Posteriormente, los investigadores estudian el tiempo de seguimiento mientras la proteína se encuentra en el proceso de interés. [ 3 ]
Una célula seleccionada o un grupo de células se expone primero a un compuesto marcado (el pulso) que se incorporará a una molécula o sistema en estudio (véase también marcaje por pulso ). El compuesto recorre las vías metabólicas y se utiliza en la síntesis del producto estudiado. Por ejemplo, se puede suministrar una forma de leucina marcada radiactivamente ( ³H -leucina) a un grupo de células beta pancreáticas , que luego utilizan este aminoácido en la síntesis de insulina .
Se pueden utilizar otras técnicas experimentales para complementar el análisis de marcaje y seguimiento. Estas incluyen tinción celular , inmunoprecipitación y SDS-PAGE .
Poco después de la introducción del compuesto marcado (generalmente unos 5 minutos, aunque el tiempo real necesario depende del objeto de estudio), se introduce en el entorno un exceso de la misma sustancia, pero sin marcar (la fase de seguimiento). Siguiendo el ejemplo anterior, la producción de insulina continuaría, pero ya no contendría la leucina radiactiva introducida en la fase de pulso y no sería visible mediante métodos de detección radiactiva. Sin embargo, el movimiento de la insulina marcada producida durante el período de pulso aún podría rastrearse dentro de la célula. [ 4 ]
Eliminación de materiales radiactivos y citotóxicos
PCA utiliza materiales radiactivos para marcar proteínas en la parte de "pulso" del experimento y materiales citotóxicos en la parte de "persecución" para detener la síntesis de proteínas. Esto es peligroso para las células que se utilizan durante los experimentos. Los investigadores han desarrollado varios métodos para utilizar materiales que no son tóxicos ni radiactivos. Ejemplos de esto incluyen el uso de L-azidohomoalanina (AHA) y 4sU. En el ejemplo de AHA, AHA se utiliza para marcar proteínas. Luego, AHA reacciona con un grupo alquino para aislar las proteínas marcadas con AHA. En este método, las células de mamíferos se lavan con tampón RIPA SDS al 0,5 % y PBS, y la vida media se calcula con fórmulas de vida media y decaimiento exponencial . Se indujo el plegamiento incorrecto de proteínas y el choque térmico en las células, y luego las células se sometieron a análisis de pulso-persecución, SDS-PAGE e inmunoblotting para determinar el comportamiento de las proteínas. Se ha demostrado que AHA es una alternativa adecuada a los materiales radiactivos y citotóxicos. Tiene resultados comparables al análisis de pulso-persecución radiactivo; La única diferencia detectada fue al usar células de mamíferos, ya que se demostró que el AHA posiblemente alteraba la respuesta al choque térmico. Las células pueden estudiarse más a fondo analizando las proteínas utilizadas, las modificaciones postraduccionales y el choque térmico para determinar la viabilidad celular. [ 1 ] [ 5 ]
El análisis de marcaje y seguimiento también se utiliza con 4sU. Los miRNAs se utilizan en la regulación génica postranscripcional y desempeñan un papel importante en el ciclo celular. Aunque el miRNA constituye una parte importante de las modificaciones postraduccionales, se sabe poco sobre cómo se degrada. Al comparar la cantidad inicial de miRNA en un PCA con la cantidad al final del experimento, se observa una disminución significativa en la cantidad de miRNA. Si bien el miRNA es estructuralmente estable, se pueden encontrar indicios de degradación y descomposición al determinar su vida media. En este PCA, el miRNA se marcó con 4sU y se separó según su "edad", es decir, si eran pri-miRNAs o miRNAs maduros . Con 4sU como marcador, los miRNAs maduros se separaron de los pri-mRNAs después del procesamiento de proteínas según la cantidad de degradación en los marcadores. La eficiencia de los miRNAs también se puede determinar mediante el análisis de marcaje y seguimiento comparando las tasas de transcripción entre pri-miRNA y mRNA maduro. [ 1 ] [ 5 ]
Impacto del material en las tasas de desintegración
En los experimentos de PCA, la cinética de las proteínas se interpreta estudiando la duración de un seguimiento. Si bien la degradación de las proteínas suele seguir modelos de decaimiento exponencial, surgen problemas al predecir las curvas de decaimiento cuando la degradación no sigue un modelo exponencial. Las proteínas pueden degradarse con el tiempo sin factores externos, pero los materiales citotóxicos y radiactivos utilizados en los experimentos de pulso-seguimiento aumentan la tasa de degradación. Los patrones de decaimiento se determinan a partir de la cantidad de proteína degradada al final de un seguimiento. Por esta razón, una degradación precisa es importante para determinar la tasa de decaimiento. Para tener en cuenta los patrones de decaimiento no exponenciales, se consideran la duración del pulso y las probabilidades de decaimiento molecular. Después de recopilar los datos experimentales, las tasas de decaimiento se muestran utilizando cadenas de Markov . Las cadenas de Markov son métodos estadísticos para determinar la probabilidad de un evento. En PCA, las cadenas de Markov se utilizan para predecir la vida media de una molécula, la tasa de decaimiento dependiente de la edad y la duración precisa del pulso. [ 6 ]
Métodos utilizados con PCA
tinción celular
La orientación de la división celular se puede determinar mediante PCA y tinción celular. La tinción celular se utiliza junto con PCA para respaldar y proporcionar datos visuales sobre los procesos celulares hipotetizados. Se tiñen diferentes partes de las células, como el huso, para visualizarlas en distintas etapas del ciclo celular. Esta información se utiliza con datos de los periodos correspondientes de "pulso" y "seguimiento". En este experimento en particular, se utiliza 5-etinil-2'-deoxiuridina (EdU) para marcar las células de las hojas de Arabidopsis thaliana . Se tiñeron los núcleos celulares y se compararon las señales de tinción y de pulso-seguimiento. El ángulo de división de las células se utilizó para determinar las etapas celulares y la dirección de la división celular. [ 7 ]
La morfología de los orgánulos celulares se puede estudiar utilizando PCA para determinar la etapa del ciclo de vida celular. Las células se pueden teñir con diversos colorantes fluorescentes como DAPI , yoduro de propidio o Hoechst para visualizar células muertas o núcleos celulares. En este experimento, se utilizan conjuntamente el inmunomarcaje y la tinción fluorescente. Las células se marcan con EdU. El experimento se realizó con células vegetales, específicamente con células de la raíz de Arabidopsis thaliana . Las células se aislaron de las plantas, se inmunomarcaron con EdU y se tiñeron con colorantes fluorescentes. La comparación de las imágenes de las células con DAPI y los resultados de PCA mostró que la cantidad de aparato de Golgi aumentó durante la fase G1 tardía del ciclo celular . [ 8 ]
Inmunoprecipitación y SDS-PAGE
La inmunoprecipitación se puede utilizar para determinar las proteínas presentes en una solución. Esto se logra descomponiendo los diferentes componentes de una macromolécula de la que forma parte la proteína. Al realizar el análisis de componentes principales (PCA), se utiliza para recuperar una proteína previamente marcada y determinar en qué etapa del proceso de procesamiento proteico se encuentra. Las macromoléculas proteicas se tratan con endoglicosidasas para descomponerlas y se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para determinar la identidad de las proteínas individuales. Esta información sobre las proteínas únicas presentes se utiliza para determinar los mecanismos de una proteína en un momento determinado. [ 3 ] Sin embargo, la inmunoprecipitación no siempre se utiliza debido a la preocupación por la identificación errónea de proteínas marcadas y no marcadas. [ 9 ]
Al realizar un experimento de PCA, las células se lavan para eliminar los restos extracelulares y los materiales que podrían interferir o generar ruido al aislar la proteína de interés. Sin embargo, este lavado puede durar hasta 15 minutos. Al intentar examinar etapas específicas de procesos biológicos, como los ciclos celulares o la degradación de proteínas , un mayor tiempo de lavado celular podría interferir con los resultados del experimento. Los experimentos de marcaje y seguimiento pueden modificarse para evitar el lavado. Los investigadores han desarrollado un método para utilizar proteínas fluorescentes y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para marcar proteínas. Se marcaron enzimas nucleofílicas y, en lugar de lavar, se eliminaron los compuestos que generan ruido mediante reacciones de eliminación . Este enfoque de PCA puede esclarecer reacciones proteicas dependientes del tiempo, como la velocidad de expresión o el movimiento de las proteínas. [ 10 ]
Usos
Este método es útil para determinar la actividad de ciertas células durante un período prolongado. Se ha utilizado para estudiar la proteína quinasa C , la ubiquitina y muchas otras proteínas. También se empleó para demostrar la existencia y función de los fragmentos de Okazaki . George Palade utilizó el marcaje por pulsos de aminoácidos radiactivos para dilucidar la vía secretora . [ 11 ] [ 12 ]
Ciencias de la salud
El análisis de componentes principales (PCA) se utiliza de diversas maneras en la investigación biomédica : emplea proteínas para estudiar la vida útil de estructuras que interactúan con ellas. Algunos ejemplos son las células madre, el procolágeno, la renovación celular y las inclusiones virales.
División y renovación celular
El análisis de marcaje y seguimiento puede utilizarse para determinar la tasa de división de las células madre. Las células madre se diferencian de las células normales en que rara vez se dividen. Los investigadores han utilizado este análisis en las células renales de ratones y ratas para estudiar el ciclo celular y la duración de la vida de las células madre. Se utilizaron pulsos de diferentes duraciones para determinar si una célula que retenía la etiqueta (LRC) era una célula madre o no. Se planteó la hipótesis de que las células que retenían sus etiquetas durante períodos más prolongados y presentaban un ciclo celular lento eran células madre. Los pulsos también se utilizaron para detectar etiquetas de análogos de ADN y para determinar el número de divisiones celulares que habían experimentado, utilizando la vida media de las células . [ 13 ]
Las tasas de recambio celular pueden monitorizarse mediante análisis de marcaje y seguimiento. Los investigadores utilizan una combinación de análisis de marcaje y seguimiento y espectrometría de masas con ionización por electrospray y ablación láser (LAESI-MS) para aumentar mecánicamente la tasa de recambio celular. Se utilizaron aminoácidos para marcar células de algas verdes fotosintéticas y de Chlamydomonas reinhardtii . El análisis de marcaje y seguimiento se utilizó para rastrear las marcas isotópicas de aminoácidos. Esto se comparó con las tasas de fotosíntesis en las células, lo que contribuyó al conocimiento del ciclo de vida celular. [ 14 ]
Procolágeno (Proteína)
El procolágeno se estudia porque desempeña un papel en enfermedades relacionadas con los tejidos conectivos. El procolágeno interactúa con el colágeno y las proteínas, y viaja a través de varios orgánulos como el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. El PCA se utiliza para estudiar la formación del procolágeno y la alteración de su formación. El PCA se realiza utilizando células no radiactivas para no alterar potencialmente la función celular. Este experimento también utiliza AHA para evitar daños al ADN. Se utilizaron células humanas para extraer procolágeno. El colágeno se marcó con colorantes fluorescentes . Además de la tinción y el marcaje por pulso-caza, también se aisló ARN de las células para realizar RT-qPCR y determinar la cantidad de ARNm y colágeno en diferentes momentos. [ 15 ] [ 16 ]
Inclusiones virales
El análisis de pulso-caza puede utilizarse para determinar cómo se replican los virus y entran en la célula. Los investigadores utilizan la pérdida de fluorescencia tras fotoactivación (FLAPh) para estudiar el virus de la influenza A (IAV) y la estructura celular durante la infección. A diferencia de la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP), FLAPh permite identificar elementos móviles. Las infecciones virales se mueven constantemente y requieren un método que permita visualizarlas en movimiento. FLAPh fotoblanquea los componentes proteicos durante periodos cortos, lo que lo convierte en un método idóneo para determinar la localización de proteínas y componentes celulares. Este método se combinó con el análisis de pulso-caza, y los investigadores utilizaron ambos métodos visuales para determinar la degradación proteica y la localización del virus en la célula a lo largo de las distintas etapas de la infección viral. [ 17 ]
Investigación
Análisis de la estructura
El análisis de componentes principales (PCA) puede utilizarse para determinar la estructura de moléculas que interactúan con proteínas. Esto se puede lograr marcando una proteína y analizando la duración de un seguimiento en un experimento, o bien analizando las concentraciones de proteínas tras un experimento de marcaje y seguimiento.
Bacteriófagos
El análisis de componentes principales (PCA) puede utilizarse para determinar la estructura de los bacteriófagos . Los investigadores emplearon el análisis de pulso-caza y observaron el intervalo entre el pulso y la caza para determinar la estructura y la formación de la cola del bacteriófago T4. En este experimento, se utilizaron aminoácidos para marcar las proteínas del bacteriófago. El fago estaba compuesto por 420 proteínas, y la posición de las proteínas de la cola se determinó mediante la duración de la caza. La caza del experimento midió el tiempo que tardaba la proteína en ensamblarse en el bacteriófago. Cuanto más hacia el interior de la proteína se desplaza la etiqueta, mayor es la duración de la caza. Las proteínas marcadas se identificaron mediante electroforesis en gel . Este procedimiento se repitió hasta determinar el orden de las proteínas en la cola del bacteriófago. [ 18 ]
Macromoléculas
Las proteínas se estudian mediante PCA para determinar cómo interactúan con una estructura macromolecular mayor . Esto se logra utilizando un aminoácido para iniciar la traducción. Una proteína marcada se une al ARNm y se realiza un seguimiento de la proteína durante la traducción. Una vez finalizada la traducción, se sigue la proteína después de la misma para determinar su comportamiento postraduccional. Los marcadores se pueden usar para aislar proteínas, las cuales se pueden lavar y analizar mediante inmunoprecipitación para identificar complejos proteína-macromolécula y otros materiales de traducción. [ 9 ]
Referencias
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- Imágenes celulares
