Resonancia paramagnética electrónica pulsada

La resonancia paramagnética electrónica pulsada (RPE) es una técnica de resonancia paramagnética electrónica que implica la alineación del vector de magnetización neta de los espines electrónicos en un campo magnético constante . Esta alineación se perturba mediante la aplicación de un campo oscilante corto, generalmente un pulso de microondas. A continuación, se puede medir la señal de microondas emitida, que es creada por la magnetización de la muestra. La transformada de Fourier de la señal de microondas produce un espectro de RPE en el dominio de la frecuencia. Con una gran variedad de secuencias de pulsos, es posible obtener un conocimiento exhaustivo de las propiedades estructurales y dinámicas de los compuestos paramagnéticos. Las técnicas de RPE pulsada, como la modulación de la envolvente del eco de espín electrónico (ESEEM) o la resonancia doble electrón-nuclear pulsada (ENDOR), pueden revelar las interacciones del espín electrónico con los espines nucleares circundantes .

La resonancia paramagnética electrónica (RPE) o resonancia de espín electrónico (ESR) es una técnica espectroscópica ampliamente utilizada en biología, química, medicina y física para estudiar sistemas con uno o más electrones desapareados. Debido a la relación específica entre los parámetros magnéticos, la función de onda electrónica y la configuración de los núcleos circundantes con espín distinto de cero, la RPE y la ENDOR proporcionan información sobre la estructura, la dinámica y la distribución espacial de las especies paramagnéticas. Sin embargo, estas técnicas presentan limitaciones en la resolución espectral y temporal cuando se utilizan con métodos tradicionales de onda continua. Esta resolución puede mejorarse en la RPE pulsada mediante el estudio independiente de las interacciones a través de secuencias de pulsos.

RJ Blume informó del primer eco de espín electrónico en 1958, que provenía de una solución de sodio en amoníaco a su punto de ebullición, -33,8 °C. ^{[ 1 ]} Se utilizó un campo magnético de 0,62 mT, lo que requirió una frecuencia de 17,4 MHz . Los primeros ecos de espín electrónico de microondas fueron reportados ese mismo año por Gordon y Bowers utilizando excitación de 23 GHz de dopantes en silicio . ^{[ 2 ]}  

Gran parte de la investigación pionera en EPR pulsada se llevó a cabo en el grupo de WB Mims en Bell Labs durante la década de 1960. En la primera década, solo un pequeño número de grupos trabajó en este campo, debido al alto costo de la instrumentación, la falta de componentes de microondas adecuados y la lentitud de la electrónica digital. La primera observación de la modulación de la envolvente del eco de espín electrónico (ESEEM) fue realizada en 1961 por Mims, Nassau y McGee. ^{[ 3 ]} La resonancia doble nuclear electrónica pulsada (ENDOR) fue inventada en 1965 por Mims. ^{[ 4 ]} En este experimento, las transiciones de RMN pulsadas se detectan con EPR pulsada. ESEEM y ENDOR pulsada siguen siendo importantes para el estudio de los espines nucleares acoplados a los espines electrónicos.

En la década de 1980, la aparición de los primeros espectrómetros comerciales de EPR y ENDOR pulsados ​​en el rango de frecuencia de banda X propició un rápido crecimiento del campo. En la década de 1990, paralelamente al auge del EPR de alto campo, el EPR y el ENDOR pulsados ​​se convirtieron en una nueva herramienta de espectroscopia de resonancia magnética de rápido avance, y apareció en el mercado el primer espectrómetro comercial de EPR y ENDOR pulsado en frecuencias de banda W.

El principio básico de la EPR pulsada y la RMN es similar. Las diferencias radican en la magnitud relativa de las interacciones magnéticas y en las velocidades de relajación, que son órdenes de magnitud mayores (más rápidas) en la EPR que en la RMN. Se ofrece una descripción completa de la teoría dentro del formalismo de la mecánica cuántica, pero dado que la magnetización se mide como una propiedad global, se puede obtener una imagen más intuitiva con una descripción clásica. Para comprender mejor el concepto de EPR pulsada, considérense los efectos sobre el vector de magnetización tanto en el sistema de referencia del laboratorio como en el sistema de referencia giratorio . Como muestra la animación a continuación, en el sistema de referencia del laboratorio se supone que el campo magnético estático B₀ _es paralelo al eje z y el campo de microondas B₁ _es paralelo al eje x. Cuando un espín electrónico se coloca en un campo magnético , experimenta un torque que provoca que su momento magnético precese alrededor del campo magnético. La frecuencia de precesión se conoce como frecuencia de Larmor ωL _. ^{[ 5 ]}

${\displaystyle \omega _ {L}=-\gamma B_ {0}}$

donde γ es la relación giromagnética y B ₀ el campo magnético. Los espines de los electrones se caracterizan por dos estados cuánticos, uno paralelo y otro antiparalelo a B ₀ . Debido a la menor energía del estado paralelo, se pueden encontrar más espines de electrones en este estado según la distribución de Boltzmann . Esta población desequilibrada da como resultado una magnetización neta, que es la suma vectorial de todos los momentos magnéticos en la muestra, paralelos al eje z y al campo magnético. Para comprender mejor los efectos del campo de microondas B ₁ es más fácil pasar al sistema de referencia giratorio.

Los experimentos de EPR suelen utilizar un resonador de microondas diseñado para crear un campo de microondas polarizado linealmente B ₁ , perpendicular al campo magnético aplicado mucho más fuerte B ₀ . El marco giratorio está fijo a los componentes giratorios de B _1. Primero suponemos que estamos en resonancia con el vector de magnetización precesional M ₀ .

${\displaystyle \omega _ {L} = \ omega _ {0}}$

Por lo tanto, el componente de B ₁ aparecerá estacionario. En este marco, los componentes de magnetización en precesión también parecen ser estacionarios, lo que lleva a la desaparición de B ₀ , y solo necesitamos considerar B ₁ y M _0. El vector M ₀ está bajo la influencia del campo estacionario B ₁ , lo que lleva a otra precesión de M ₀ , esta vez alrededor de B ₁ a la frecuencia ω ₁ .

${\displaystyle \omega _ {1}=-\gamma B_ {1}}$

Esta frecuencia angular ω ₁ también se denomina frecuencia de Rabi . Suponiendo que B ₁ es paralelo al eje x, el vector de magnetización girará alrededor del eje +x en el plano zy mientras se apliquen las microondas. El ángulo de rotación de M ₀ se denomina ángulo de inclinación α y viene dado por:

${\displaystyle \alpha =-\gamma |B_{1}|t_{p}}$

Aquí, t _p es la duración durante la cual se aplica B ₁ , también llamada duración del pulso. Los pulsos se etiquetan por la rotación de M ₀ que causan y la dirección de donde provienen, ya que las microondas pueden estar desfasadas del eje x al eje y. Por ejemplo, un pulso +y π/2 significa que un campo B ₁ , que ha sido desfasado 90 grados desde la dirección +x hacia la dirección +y, ha rotado M ₀ en un ángulo de inclinación de π/2, por lo que la magnetización terminaría a lo largo del eje –x. Esto significa que la posición final del vector de magnetización M ₀ depende de la duración, la magnitud y la dirección del pulso de microondas B _1. Para comprender cómo la muestra emite microondas después del pulso de microondas intenso, necesitamos volver al sistema de referencia del laboratorio. En el sistema de referencia giratorio y en resonancia, la magnetización parecía estar estacionaria a lo largo del eje x o y después del pulso. En el sistema de referencia del laboratorio, se produce una magnetización rotatoria en el plano xy a la frecuencia de Larmor. Esta rotación genera una señal que se maximiza si el vector de magnetización se encuentra exactamente en el plano xy. Esta señal de microondas generada por el vector de magnetización rotatoria se denomina decaimiento de inducción libre (FID). ^{[ 6 ]}

Otra suposición que hicimos fue la condición de resonancia exacta, en la que la frecuencia de Larmor es igual a la frecuencia de microondas. En realidad, los espectros EPR tienen muchas frecuencias diferentes y no todas pueden estar exactamente en resonancia, por lo que necesitamos tener en cuenta los efectos de desintonización. Los efectos de desintonización conducen a tres consecuencias principales. La primera consecuencia se puede entender mejor en el marco giratorio. Un pulso π/2 deja magnetización en el plano xy, pero como el campo de microondas (y por lo tanto el marco giratorio) no tiene la misma frecuencia que el vector de magnetización en precesión, el vector de magnetización rota en el plano xy, ya sea más rápido o más lento que el campo magnético de microondas B ₁ . La velocidad de rotación está gobernada por la diferencia de frecuencia Δω.

${\displaystyle \Delta \omega =\omega -\omega _{0}}$

Si Δω es 0, el campo de microondas rota tan rápido como el vector de magnetización y ambos parecen estar estacionarios entre sí. Si Δω>0, la magnetización rota más rápido que el componente del campo de microondas en un movimiento en sentido antihorario, y si Δω<0, la magnetización es más lenta y rota en sentido horario. Esto significa que los componentes de frecuencia individuales del espectro EPR aparecerán como componentes de magnetización rotando en el plano xy con la frecuencia de rotación Δω. La segunda consecuencia aparece en el marco del laboratorio. Aquí, B ₁ inclina la magnetización de manera diferente fuera del eje z, ya que B ₀ no desaparece cuando no está en resonancia debido a la precesión del vector de magnetización en Δω. Eso significa que la magnetización ahora está inclinada por un campo magnético efectivo B _eff , que se origina de la suma vectorial de B ₁ y B _0. La magnetización se inclina entonces alrededor de B _eff a una velocidad efectiva más rápida ω _eff .

${\displaystyle \omega _{eff}=(\omega _{1}^{2}+\Delta \omega ^{2})^{1/2}}$

Esto conduce directamente a la tercera consecuencia: la magnetización no puede orientarse eficientemente hacia el plano xy porque B _eff no se encuentra en dicho plano, a diferencia de B _1. El movimiento de la magnetización ahora define un cono. Esto significa que, a medida que Δω aumenta, la magnetización se orienta con menor eficacia hacia el plano xy y la señal FID disminuye. En espectros EPR amplios, donde Δω > ω _1, no es posible orientar toda la magnetización hacia el plano xy para generar una señal FID intensa. Por ello, es importante maximizar ω ₁ o minimizar la duración del pulso π/2 para obtener señales EPR amplias.

Hasta ahora, la magnetización se había orientado hacia el plano xy y permanecía allí con la misma magnitud. Sin embargo, en realidad, los espines de los electrones interactúan con su entorno y la magnetización en el plano xy decae y finalmente vuelve a alinearse con el eje z. Este proceso de relajación se describe mediante el tiempo de relajación espín-red _T₁ , que es un tiempo característico que necesita la magnetización para volver al eje z, y mediante el tiempo de relajación espín-espín _T₂ , que describe el tiempo de desaparición de la magnetización en el plano xy. La relajación espín-red resulta de la tendencia del sistema a regresar al equilibrio térmico después de haber sido perturbado por el pulso B₁ _. El retorno de la magnetización paralela a B₀ _se logra mediante interacciones con el entorno, es decir, la relajación espín-red. El tiempo de relajación correspondiente debe tenerse en cuenta al extraer una señal del ruido, donde el experimento debe repetirse varias veces, lo más rápido posible. Para repetir el experimento, hay que esperar a que se recupere la magnetización a lo largo del eje z, porque si no hay magnetización en la dirección z, entonces no hay nada que se incline hacia el plano xy para crear una señal significativa.

El tiempo de relajación espín-espín, también llamado tiempo de relajación transversal, está relacionado con el ensanchamiento homogéneo e inhomogéneo. El ensanchamiento inhomogéneo se produce cuando los diferentes espines experimentan inhomogeneidades en el campo magnético local (entornos distintos), lo que genera un gran número de paquetes de espín caracterizados por una distribución de Δω. A medida que el vector de magnetización neto precesa, algunos paquetes de espín se ralentizan debido a campos más bajos y otros se aceleran debido a campos más altos, lo que provoca una dispersión del vector de magnetización y, en consecuencia, la disminución de la señal de RPE. Los demás paquetes contribuyen a la disminución de la magnetización transversal debido al ensanchamiento homogéneo. En este proceso, todos los espines de un mismo paquete experimentan el mismo campo magnético e interactúan entre sí, lo que puede dar lugar a cambios de espín mutuos y aleatorios. Estas fluctuaciones contribuyen a una dispersión más rápida del vector de magnetización.

Toda la información sobre el espectro de frecuencias está codificada en el movimiento de la magnetización transversal. El espectro de frecuencias se reconstruye utilizando la evolución temporal de la magnetización transversal, compuesta por componentes en los ejes y y x. Resulta conveniente que estas dos componentes puedan tratarse como las componentes real e imaginaria de una magnitud compleja, y utilizar la teoría de Fourier para transformar la señal medida en el dominio del tiempo a su representación en el dominio de la frecuencia. Esto es posible gracias a la detección tanto de la señal de absorción (real) como de la de dispersión (imaginaria).

La señal FID decae y para espectros EPR muy amplios este decaimiento es bastante rápido debido al ensanchamiento inhomogéneo. Para obtener más información se puede recuperar la señal desaparecida con otro pulso de microondas para producir un eco de Hahn . ^{[ 7 ]} Después de aplicar un pulso π/2 (90°), el vector de magnetización se inclina en el plano xy produciendo una señal FID. Diferentes frecuencias en el espectro EPR (ensanchamiento inhomogéneo) hacen que esta señal se "expanda", lo que significa que los paquetes de espín más lentos se quedan atrás de los más rápidos. Después de un cierto tiempo t , se aplica un pulso π (180°) al sistema invirtiendo la magnetización, y los paquetes de espín rápidos se quedan atrás alcanzando a los paquetes de espín lentos. Luego ocurre un reenfoque completo de la señal en el tiempo 2t . Un eco preciso causado por un segundo pulso de microondas puede eliminar todos los efectos de ensanchamiento inhomogéneo. Después de que todos los paquetes de espín se agrupan, se desfasarán nuevamente como una FID. En otras palabras, un eco de espín es una señal FID invertida seguida de una señal FID normal, que se puede transformar mediante la transformada de Fourier para obtener el espectro EPR. Cuanto mayor sea el tiempo entre los pulsos, menor será el eco debido a la relajación de espín. Cuando esta relajación produce una disminución exponencial de la amplitud del eco, la constante de decaimiento es el tiempo de memoria de fase T _M , que puede tener diversas contribuciones, como la relajación transversal, la difusión espectral, de espín y la instantánea. Al modificar los tiempos entre los pulsos, se puede medir directamente T _M, como se muestra en la animación del decaimiento del eco de espín a continuación.

ESEEM ^{[ 3 ] [ 5 ]} y ENDOR pulsado ^{[ 4 ] [ 5 ]} son ​​experimentos de eco ampliamente utilizados , en los que se puede estudiar y controlar la interacción de los espines de los electrones con los núcleos en su entorno.

Un experimento popular de EPR pulsado actualmente es la resonancia doble electrón-electrón (DEER), también conocida como resonancia doble electrón-electrón pulsada (PELDOR). ^{[ 5 ]} En este experimento, dos frecuencias controlan dos espines para analizar su acoplamiento. La distancia entre los espines se puede inferir a partir de la fuerza de su acoplamiento. Esta información se utiliza para dilucidar estructuras de grandes biomoléculas. La espectroscopia PELDOR es una herramienta versátil para investigaciones estructurales de proteínas, incluso en un entorno celular. ^{[ 8 ]}

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