microscopía de bomba-sonda

La absorción de dos fotones (TPA) es un proceso de tercer orden en el que dos fotones son absorbidos casi simultáneamente por la misma molécula. Si un segundo fotón es absorbido por el mismo electrón dentro del mismo evento cuántico, el electrón entra en un estado excitado . ^{[ 4 ]}

Este es el mismo fenómeno que se utiliza en la microscopía de dos fotones (TPM), pero existen dos características clave que distinguen la microscopía de bombeo-sonda de la TPM. En primer lugar, dado que la molécula no es necesariamente fluorescente, un fotodetector mide la intensidad de la sonda. Por lo tanto, la señal disminuye a medida que se produce la absorción de dos fotones, lo contrario de la TPM. ^{[ 3 ]}

En segundo lugar, la microscopía de bombeo-sonda utiliza fuentes espectralmente separadas para cada fotón, mientras que la TPM convencional utiliza una fuente de una sola longitud de onda. Esto se conoce como excitación de dos fotones degenerada. ^{[ 3 ]}

La absorción en estado excitado (ESA) ocurre cuando el haz de bombeo envía un electrón a un estado excitado, y luego el haz de sonda lo envía a un estado excitado aún mayor. Esto difiere de la TPA principalmente en la escala de tiempo en la que ocurre. Dado que un electrón puede permanecer en un estado excitado durante un período de nanosegundos , se requieren duraciones de pulso más largas que en la TPA. ^{[ 5 ]}

La microscopía de bombeo-sonda también permite medir la emisión estimulada . En este caso, el haz de bombeo impulsa al electrón a un estado excitado. Posteriormente, el electrón emite un fotón al ser expuesto al haz de sonda. Esta interacción incrementa la señal de la sonda en el detector.

El agotamiento del estado fundamental ocurre cuando el haz de bombeo envía el electrón a un estado excitado. Sin embargo, a diferencia de la ESA, el haz de sonda no puede enviar un electrón a un estado excitado secundario. En cambio, envía los electrones restantes del estado fundamental al primer estado excitado. No obstante, dado que el haz de bombeo ha disminuido el número de electrones en el estado fundamental, se absorben menos fotones de sonda y la señal de sonda aumenta en el detector. ^{[ 3 ]}

La modulación de fase cruzada es causada por el efecto Kerr , en el cual el índice de refracción de la muestra cambia en presencia de un campo eléctrico intenso . ^{[ 6 ]} En este caso, el haz de bombeo modula la fase de la sonda, que luego puede medirse mediante técnicas interferométricas . En ciertos casos, denominados desplazamiento espectral por modulación de fase cruzada , este cambio de fase induce una modificación en el espectro de bombeo que puede detectarse con un filtro espectral. ^{[ 3 ]}

La medición de interacciones ópticas no lineales requiere una alta potencia instantánea y una sincronización muy precisa. Para lograr la gran cantidad de fotones necesarios para generar estas interacciones, evitando al mismo tiempo dañar muestras delicadas, estos microscopios requieren un láser de bloqueo de modos . Estos láseres pueden alcanzar recuentos de fotones muy altos en la escala de femtosegundos y mantener una baja potencia promedio. La mayoría de los sistemas utilizan un medio de ganancia de Ti:Zafiro debido al amplio rango de longitudes de onda al que puede acceder. ^{[ 3 ] [ 7 ]}

Normalmente, se utiliza la misma fuente para generar el haz de bombeo y el de sonda. Un oscilador paramétrico óptico (OPO) se emplea para convertir el haz de sonda a la longitud de onda deseada. La longitud de onda de la sonda puede ajustarse en un amplio rango para aplicaciones espectroscópicas. ^{[ 7 ]}

Sin embargo, para ciertos tipos de interacciones de dos fotones, es posible utilizar fuentes pulsadas separadas. ^{[ 3 ]} Esto solo es posible con interacciones como la absorción en estado excitado, en la que los electrones permanecen en dicho estado durante varios picosegundos. No obstante, es más común utilizar una única fuente de femtosegundos con dos trayectorias de haz separadas de diferentes longitudes para modular la sincronización entre los haces de bombeo y de sonda. ^{[ 3 ] [ 7 ]}

La amplitud del haz de bombeo se modula mediante un modulador acustoóptico o electroóptico del orden de 10⁷ ^Hz  . Los haces de bombeo y de sonda se recombinan mediante un divisor de haz dicroico y se escanean con espejos galvanométricos para generar imágenes punto por punto antes de enfocarlas sobre la muestra. ^{[ 3 ]}

La señal generada por la modulación de la sonda es mucho menor que el haz de bombeo original, por lo que ambos se separan espectralmente dentro de la trayectoria de detección mediante un espejo dicroico . La señal de la sonda se puede captar con diversos tipos de fotodetectores , generalmente un fotodiodo . A continuación, la señal modulada se amplifica mediante un amplificador lock-in sintonizado a la frecuencia de modulación del bombeo. ^{[ 3 ]}

En el ajuste multiexponencial, las curvas resueltas en el tiempo se ajustan con un modelo de decaimiento exponencial para determinar las constantes de decaimiento. Si bien este método es sencillo, tiene baja precisión. ^{[ 7 ]}

El análisis de componentes principales (ACP) fue uno de los primeros métodos utilizados para el análisis de datos de bombeo-sonda, y se utiliza comúnmente para el análisis de datos hiperespectrales. El ACP descompone los datos en componentes ortogonales. En estudios de melanoma , los componentes principales han mostrado una buena concordancia con las señales obtenidas de las diferentes formas de melanina . ^{[ 10 ]} Una ventaja del ACP es que el ruido se puede reducir conservando solo los componentes principales que explican la mayor parte de la varianza en los datos. Sin embargo, los componentes principales no necesariamente reflejan las propiedades reales de las especies químicas subyacentes , que suelen ser no ortogonales. ^{[ 3 ]} Por lo tanto, una limitación es que el número de especies químicas únicas no se puede inferir utilizando el ACP. ^{[ 3 ]}

El análisis de fasores se utiliza comúnmente para el análisis de datos de microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) ^{[ 11 ]} y se ha adaptado para el análisis de datos de imágenes de bombeo-sonda. ^{[ 8 ]} Las señales se descomponen en sus partes real e imaginaria de la transformada de Fourier a una frecuencia dada. Al graficar las partes real e imaginaria una contra la otra, se puede mapear la distribución de diferentes cromóforos con tiempos de vida distintos. ^{[ 3 ] [ 7 ]} En estudios de melanoma, este enfoque ha demostrado nuevamente ser capaz de distinguir entre las diferentes formas de melanina. ^{[ 8 ]} Una de las principales ventajas del análisis de fasores es que proporciona una vista gráfica y cualitativa intuitiva del contenido. ^{[ 7 ]} También se ha combinado con PCA para el análisis cuantitativo. ^{[ 12 ]}

La microscopía de bombeo-sonda es ideal para el estudio y la caracterización de nanomateriales , como el grafeno , ^{[ 13 ]} nanocubos, ^{[ 14 ]} nanocables, ^{[ 15 ]} y una variedad de semiconductores, ^{[ 16 ] [ 17 ]} debido a sus altas susceptibilidades pero baja fluorescencia. En particular, los nanotubos de carbono de pared simple se han estudiado y visualizado extensamente con resolución submicrométrica, ^{[ 18 ]} proporcionando detalles sobre la dinámica de portadores, propiedades fotofísicas y fotoquímicas. ^{[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]}

La primera aplicación de la técnica de bombeo-sonda en biología fue la obtención de imágenes in vitro de la emisión estimulada de una célula marcada con un colorante. ^{[ 22 ]} Actualmente, la obtención de imágenes mediante bombeo-sonda se utiliza ampliamente para la obtención de imágenes de melanina con el fin de diferenciar entre las dos formas principales de melanina : eumelanina (marrón/negra) y feomelanina (roja/amarilla). ^{[ 23 ]} En el melanoma, la eumelanina está sustancialmente aumentada. Por lo tanto, la obtención de imágenes de la distribución de eumelanina y feomelanina puede ayudar a distinguir las lesiones benignas del melanoma con alta sensibilidad. ^{[ 24 ]} 

Las obras de arte se componen de numerosos pigmentos con un amplio rango de propiedades de absorción espectral, que determinan su color. Debido a las amplias características espectrales de estos pigmentos, resulta difícil identificar un pigmento específico en una mezcla. La técnica de imagen de bombeo-sonda permite obtener información molecular precisa y de alta resolución ^{[ 25 ]} y distinguir entre pigmentos que incluso pueden tener el mismo color visual. ^{[ 26 ]}