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complejo de silenciamiento inducido por ARN

El complejo de silenciamiento inducido por ARN , o RISC , es un complejo multiproteico , específicamente una ribonucleoproteína , que funciona en el silenciamiento génico a trav...

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El complejo de silenciamiento inducido por ARN , o RISC , es un complejo multiproteico , específicamente una ribonucleoproteína , que funciona en el silenciamiento génico a través de diversas vías a nivel transcripcional y traduccional. [ 1 ] Utilizando fragmentos de ARN monocatenario (ARNmc), como el microARN (miARN), o ARN de interferencia pequeño bicatenario (ARNi), el complejo funciona como una herramienta clave en la regulación génica. [ 2 ] La cadena simple de ARN actúa como plantilla para que RISC reconozca el transcrito de ARN mensajero (ARNm) complementario . Una vez encontrado, una de las proteínas de RISC, Argonaute , activa y escinde el ARNm. Este proceso se denomina interferencia de ARN (ARNi) y se encuentra en muchos eucariotas ; es un proceso clave en la defensa contra infecciones virales , ya que se desencadena por la presencia de ARN bicatenario (ARNdc). [ 3 ] [ 4 ] [ 1 ]

Descubrimiento

La identificación bioquímica del RISC fue realizada por Gregory Hannon y sus colegas en el Laboratorio Cold Spring Harbor . [ 5 ] Esto ocurrió apenas un par de años después del descubrimiento de la interferencia de ARN en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello , quienes compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006. [ 3 ]

Drosophila melanogaster

Hannon y sus colegas intentaron identificar los mecanismos de ARN de interferencia (ARNi) implicados en el silenciamiento génico , mediante ARN bicatenarios (ARNdc), en células de Drosophila . Se transfectaron células S2 de Drosophila con un vector de expresión de lacZ para cuantificar la expresión génica con actividad de β-galactosidasa . Sus resultados mostraron que la cotransfección con ARNdc de lacZ redujo significativamente la actividad de β-galactosidasa en comparación con el ARNdc de control. Por lo tanto, los ARNdc controlan la expresión génica mediante complementariedad de secuencia .

Posteriormente, las células S2 se transfectaron con ARN bicatenario (dsRNA ) de ciclina E de Drosophila . La ciclina E es un gen esencial para la progresión del ciclo celular hacia la fase S. El dsRNA de ciclina E detuvo el ciclo celular en la fase G1 (antes de la fase S ). Por lo tanto, la interferencia de ARN (ARNi) puede dirigirse a genes endógenos .

Además, el ARN bicatenario de ciclina E solo disminuyó el ARN de ciclina E; se observó un resultado similar con el ARN bicatenario correspondiente a la ciclina A , que actúa en las fases S, G2 y M del ciclo celular. Esto demuestra la característica distintiva de la interferencia de ARN: los niveles reducidos de ARNm se corresponden con los niveles de ARN bicatenario añadido.

Para comprobar si su observación de niveles reducidos de ARNm era el resultado de que el ARNm fuera el objetivo directo (como sugerían los datos de otros sistemas), se transfectaron células S2 de Drosophila con ARN bicatenarios de ciclina E de Drosophila o ARN bicatenarios de lacZ y luego se incubaron con ARNm sintéticos para ciclina E o lacZ .

Las células transfectadas con dsRNA de ciclina E solo mostraron degradación en los transcritos de ciclina E; los transcritos de lacZ fueron estables. Por el contrario, las células transfectadas con dsRNA de lacZ solo mostraron degradación en los transcritos de lacZ y no en los de ciclina E. Sus resultados llevaron a Hannon y sus colegas a sugerir que el ARN de interferencia degrada el ARNm diana a través de una "actividad nucleasa específica de secuencia ". Denominaron a la enzima nucleasa RISC. [ 5 ] Posteriormente, Devanand Sarkar y sus colegas Prasanna K. Santhekadur y Byoung Kwon Yoo en la Universidad de la Commonwealth de Virginia dilucidaron la actividad RISC y su mecanismo molecular en células cancerosas e identificaron otro nuevo componente del RISC, llamado AEG-1 [47].

Función en la interferencia de ARN

El dominio PIWI de una proteína Argonaute en complejo con ARN de doble cadena.

Incorporación de siRNA/miRNA

La RNasa III Dicer es un miembro crítico del RISC que inicia el proceso de interferencia de ARN mediante la producción de siRNA de doble cadena o miRNA de cadena simple. La escisión enzimática del dsRNA dentro de la célula produce fragmentos cortos de siRNA de 21-23 nucleótidos de longitud con un saliente 3' de dos nucleótidos . [ 6 ] [ 7 ] Dicer también procesa el pre-miRNA, que forma una estructura de horquilla para imitar el dsRNA, de manera similar. Los fragmentos de dsRNA se cargan en el RISC, y cada cadena tiene un destino diferente basado en el fenómeno de la regla de asimetría, la selección de una cadena como cadena guía sobre la otra en función de la estabilidad termodinámica. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] El miRNA o siRNA recién generado actúa como secuencias guía de cadena simple para que el RISC dirija el ARNm para su degradación. [ 12 ] [ 13 ]

  • La hebra con el extremo 5' termodinámicamente menos estable es seleccionada por la proteína Argonaute e integrada en RISC. [ 11 ] [ 14 ] Esta hebra se conoce como hebra guía y dirige el ARNm para su degradación.
  • La otra hebra, conocida como hebra pasajera, es degradada por RISC. [ 15 ]
Parte de la vía de interferencia de ARN con las diferentes formas en que RISC puede silenciar genes a través de su ARN mensajero.

Regulación genética

AGO2 (gris) en complejo con un microARN (azul claro) y su ARNm diana (azul oscuro).

Las principales proteínas de RISC, Ago2, SND1 y AEG-1, actúan como contribuyentes cruciales a la función de silenciamiento génico del complejo. [ 16 ]

RISC utiliza la cadena guía de miRNA o siRNA para dirigirse a regiones 3' no traducidas complementarias (3'UTR) de los transcritos de ARNm mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick , lo que le permite regular la expresión génica del transcrito de ARNm de varias maneras. [ 17 ] [ 1 ]

degradación del ARNm

La función más comprendida del RISC es la degradación del ARNm diana, lo que reduce los niveles de transcrito disponibles para ser traducidos por los ribosomas . La escisión endonucleolítica del ARNm complementario a la cadena guía del RISC por la proteína Argonaute es la clave para la iniciación del ARN de interferencia (ARNi). [ 18 ] Existen dos requisitos principales para que se produzca la degradación del ARNm:

  • una coincidencia complementaria casi perfecta entre la hebra guía y la secuencia de ARNm objetivo, y
  • una proteína Argonaute catalíticamente activa, llamada "rebanadora", para cortar el ARNm objetivo. [ 1 ]

Una vez que se ha producido la escisión del ARNm, existen dos vías principales de degradación. Ambas se inician mediante la degradación de la cola de poli(A) del ARNm , lo que da como resultado la eliminación de la caperuza 5' del ARNm.

Represión traslacional

RISC puede modular la carga de ribosomas y factores accesorios en la traducción para reprimir la expresión del ARNm unido. La represión traslacional solo requiere una coincidencia parcial de secuencia entre la cadena guía y el ARNm diana. [ 1 ]

La traducción puede regularse en la etapa de iniciación mediante:

La traducción puede regularse en las etapas posteriores a la iniciación mediante:

  • degradación de péptidos,
  • promoviendo la terminación prematura de los ribosomas de traducción, [ 21 ] o,
  • ralentizando la elongación. [ 22 ]

Todavía se especula sobre si la represión traslacional a través de la iniciación y la post-iniciación es mutuamente excluyente.

Formación de heterocromatina

Algunos RISC pueden dirigirse directamente al genoma reclutando histona metiltransferasas para formar heterocromatina en el locus génico , silenciando así el gen. Estos RISC adoptan la forma de un complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS). El ejemplo mejor estudiado es el RITS de la levadura . [ 1 ] [ 23 ] [ 24 ]

Se ha demostrado que RITS dirige la formación de heterocromatina en los centrómeros mediante el reconocimiento de repeticiones centroméricas. Mediante el apareamiento de bases del siRNA (cadena guía) con secuencias de cromatina diana, se pueden reclutar enzimas modificadoras de histonas. [ 25 ]

El mecanismo no se comprende del todo; sin embargo, las RITS degradan los transcritos de ARNm nacientes. Se ha sugerido que este mecanismo actúa como un « bucle de retroalimentación autorreforzante », ya que la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) utiliza los transcritos nacientes degradados para generar más siARN. [ 26 ]

En Schizosaccharomyces pombe y Arabidopsis , el procesamiento de ARN bicatenario (dsRNA) en siRNA por las ARNasa Dicer puede iniciar una vía de silenciamiento génico mediante la formación de heterocromatina. Una proteína Argonaute conocida como AGO4 interactúa con los ARN pequeños que definen las secuencias heterocromáticas. Una histona metiltransferasa (HMT), H3K9 , metila la histona H3 y recluta proteínas con cromodominio a los sitios de metilación. La metilación del ADN mantiene el silenciamiento de los genes a medida que las secuencias de heterocromatina se establecen o se propagan. [ 27 ]

eliminación de ADN

El siRNA generado por los RISC parece desempeñar un papel en la degradación del ADN durante el desarrollo del macronúcleo somático en ciliados del género Tetrahymena . Es similar al control epigenético de la formación de heterocromatina y se postula como una defensa contra elementos genéticos invasores. [ 27 ]

De forma similar a la formación de heterocromatina en S. pombe y Arabidopsis , una proteína de Tetrahymena  relacionada con la familia Argonaute, Twi1p, cataliza la eliminación de secuencias diana del ADN conocidas como secuencias de eliminación interna (IES). Mediante metiltransferasas y proteínas con cromodominio, las IES se heterocromatizan y se eliminan del ADN. [ 27 ]

Proteínas asociadas al complejo RISC

La estructura completa del complejo RISC aún no se ha dilucidado. Muchos estudios han reportado una variedad de tamaños y componentes para el complejo RISC, pero no se sabe con certeza si esto se debe a la existencia de varios complejos RISC o a las diferentes fuentes utilizadas en los distintos estudios. [ 28 ]

Ago, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, ortólogo de D. melanogaster de la desenrollasa de ARN p68 de mamíferos; eIF2C1, factor de iniciación de la traducción eucariótica 2C1; eIF2C2, factor de iniciación de la traducción eucariótica 2C2; Fmr1/Fxr, ortólogo de D. melanogaster de la proteína de retraso mental del cromosoma X frágil; miRNP, complejo de miRNA-proteína; NR, no informado; Tsn, nucleasa estafilocócica Tudor; Vig, gen intrónico vasa.

Una proteína argonauta de longitud completa de la especie de arquea Pyrococcus furiosus .

En cualquier caso, es evidente que las proteínas Argonaute están presentes y son esenciales para su función. Además, se han obtenido datos sobre algunas de las proteínas clave (además de Argonaute) dentro del complejo, que permiten que RISC lleve a cabo su función.

Proteínas Argonaute

Las proteínas Argonaute son una familia de proteínas presentes en procariotas y eucariotas. Se desconoce su función en procariotas, pero en eucariotas son responsables de la interferencia de ARN (ARNi). [ 43 ] En los humanos, existen ocho miembros de la familia Argonaute, de los cuales solo Argonaute 2 participa exclusivamente en la escisión dirigida de ARN en el complejo RISC. [ 40 ]

El complejo de carga RISC permite que los fragmentos de ARN bicatenario (generados por Dicer) se carguen en Argonaute 2 (con la ayuda de TRBP) como parte de la vía de interferencia de ARN.

complejo de carga RISC

El complejo de carga RISC (RLC) es la estructura esencial necesaria para cargar fragmentos de ARN bicatenario en el complejo RISC y dirigirlos al ARNm. El RLC está compuesto por Dicer, la proteína de unión a ARN de respuesta transactivadora ( TRBP ) y Argonaute 2.

  • Dicer es una endonucleasa RNasa III que genera los fragmentos de ARN bicatenario que se cargan y que dirigen la interferencia de ARN (ARNi).
  • TRBP es una proteína con tres dominios de unión a ARN de doble cadena .
  • La proteína Argonaute 2 es una ARNasa y es el centro catalítico del complejo RISC.

Dicer se asocia con TRBP y Argonaute 2 para facilitar la transferencia de los fragmentos de dsRNA generados por Dicer a Argonaute 2. [ 44 ] [ 45 ]

Investigaciones más recientes han demostrado que la helicasa de ARN humana A podría ayudar a facilitar el RLC. [ 46 ]

Otras proteínas

Los miembros de RISC identificados recientemente son SND1 y MTDH . [ 47 ] SND1 y MTDH son oncogenes y regulan la expresión de varios genes. [ 48 ]

Ago, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, ortólogo de D. melanogaster de la desenrollasa de ARN p68 de mamíferos; eIF2C1, factor de iniciación de la traducción eucariótica 2C1; eIF2C2, factor de iniciación de la traducción eucariótica 2C2; Fmr1/Fxr, ortólogo de D. melanogaster de la proteína de retraso mental del cromosoma X frágil; Tsn, nucleasa estafilocócica Tudor; Vig, gen intrónico vasa.

Unión del ARNm

Diagrama de la actividad del complejo RISC con microARN

Todavía no está claro cómo el complejo RISC activado localiza los ARNm diana en la célula, aunque se ha demostrado que el proceso puede ocurrir en situaciones ajenas a la traducción de proteínas en curso a partir del ARNm. [ 50 ]

Los miRNA expresados ​​endógenamente en metazoos generalmente no son perfectamente complementarios a un gran número de genes y, por lo tanto, modulan la expresión mediante represión traslacional. [ 51 ] [ 52 ] Sin embargo, en las plantas , el proceso tiene una especificidad mucho mayor para el ARNm diana y, por lo general, cada miRNA se une solo a un ARNm. Una mayor especificidad significa que es más probable que ocurra la degradación del ARNm. [ 53 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • Fu Q, Yuan YA (marzo de 2013). "Perspectivas estructurales sobre el ensamblaje de RISC facilitado por dominios de unión a ARN bicatenario de la helicasa de ARN humana A (DHX9)" . Nucleic Acids Research . 41 (5): 3457–70 . doi : 10.1093/nar/gkt042 . PMC 3597700. PMID 23361462 .  
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