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interferencia de ARN

Administración lentiviral de shRNA diseñados y el mecanismo de interferencia de ARN en células de mamíferos La interferencia de ARN ( ARNi ) es un proceso biológico en el que la...

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Administración lentiviral de shRNA diseñados y el mecanismo de interferencia de ARN en células de mamíferos

La interferencia de ARN ( ARNi ) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN participan en la supresión secuencia-específica de la expresión génica mediante ARN de doble cadena , a través de la represión traslacional o transcripcional. Históricamente, la ARNi se conocía con otros nombres, como cosupresión , silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) y represión . El estudio detallado de cada uno de estos procesos aparentemente diferentes dilucidó que la identidad de todos estos fenómenos era, en realidad, ARNi. Andrew Fire y Craig Mello compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006 por su trabajo sobre la ARNi en el nematodo Caenorhabditis elegans , publicado en 1998. Desde el descubrimiento de la ARNi y su potencial regulador, se ha hecho evidente que la ARNi tiene un inmenso potencial para la supresión de genes deseados. Actualmente, se sabe que la ARNi es precisa, eficiente, estable y superior a la terapia antisentido para la supresión génica. [ 1 ] El ARN antisentido producido intracelularmente por un vector de expresión puede desarrollarse y encontrar utilidad como nuevos agentes terapéuticos. [ 2 ]

Dos tipos de moléculas pequeñas de ácido ribonucleico (ARN), el microARN (miARN) y el ARN de interferencia pequeño (siARN), son componentes esenciales de la vía de ARN de interferencia (ARNi). Una vez que el ARNm se degrada, se produce el silenciamiento postranscripcional al impedirse la traducción de proteínas. La transcripción puede inhibirse mediante el mecanismo de silenciamiento pretranscripcional del ARNi, a través del cual un complejo enzimático cataliza la metilación del ADN en posiciones genómicas complementarias al siARN o miARN del complejo. El ARNi desempeña un papel importante en la defensa de las células contra secuencias de nucleótidos parasitarias (por ejemplo, virus o transposones ) y también influye en el desarrollo de los organismos.

La vía de ARN de interferencia (ARNi) es un proceso natural presente en muchos eucariotas . Se inicia mediante la enzima Dicer , que escinde largas moléculas de ARN bicatenario (ARNdc) en fragmentos cortos bicatenarios de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos , denominados ARNip. Cada ARNip se desenrolla en dos ARN monocatenarios (ARNmc): la cadena pasajera (sentido) y la cadena guía (antisentido). La proteína Argonaute 2 (Ago2) escinde la cadena pasajera. Esta se degrada y la cadena guía se incorpora al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El complejo RISC se une al ARNm diana y lo degrada. Específicamente, esto se logra cuando la cadena guía se aparea con una secuencia complementaria en una molécula de ARNm e induce la escisión por Ago2, un componente catalítico del RISC. En algunos organismos, este proceso se propaga sistémicamente, a pesar de las concentraciones molares inicialmente limitadas de siRNA. [ 3 ]

La ARN de interferencia (ARNi) es una valiosa herramienta de investigación, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos , ya que el ARN bicatenario sintético introducido en las células puede inducir de forma selectiva y robusta la supresión de genes específicos de interés. La ARNi puede utilizarse para realizar cribados a gran escala que desactivan sistemáticamente cada gen (y las proteínas que codifica) en la célula, lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular particular o un evento como la división celular . Esta vía también se utiliza como herramienta práctica en la industria alimentaria, farmacéutica y en el desarrollo de insecticidas . [ 4 ]

Mecanismo celular

La proteína Dicer de Giardia , que cataliza la escisión del ARN bicatenario en ARNip. Los dominios de ARNasa están coloreados de verde, el dominio PAZ de amarillo, el dominio de plataforma de rojo y la hélice conectora de azul. [ 5 ]

La ARN de interferencia ( ARNi) es un proceso de silenciamiento génico dependiente de ARN , controlado por el complejo RISC e iniciado por moléculas cortas de ARN bicatenario en el citoplasma celular, donde interactúan con la proteína Argonaute, componente catalítico del complejo RISC . [ 6 ] Cuando el ARN bicatenario es exógeno (proveniente de la infección por un virus con genoma de ARN o de manipulaciones de laboratorio), se importa directamente al citoplasma y Dicer lo fragmenta en trozos cortos. El ARN bicatenario iniciador también puede ser endógeno (originado en la célula), como en el caso de los pre-microARN expresados ​​a partir de genes codificadores de ARN en el genoma. Los transcritos primarios de dichos genes se procesan primero para formar la estructura característica de tallo-bucle del pre-miARN en el núcleo , y luego se exportan al citoplasma. De este modo, las dos vías del ARN bicatenario, exógena y endógena, convergen en el complejo RISC. [ 7 ]

El dsRNA exógeno inicia la RNAi activando la proteína ribonucleasa Dicer, [ 8 ] que se une y corta los dsRNA en plantas, o los ARN de horquilla corta (shRNA) en humanos, para producir fragmentos de doble cadena de 20 a 25 pares de bases con un saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3'. [ 9 ] Estudios bioinformáticos en los genomas de múltiples organismos sugieren que esta longitud maximiza la especificidad del gen diana y minimiza los efectos no específicos. [ 10 ] Estos fragmentos cortos de doble cadena se llaman siRNA . Estos siRNA se separan luego en cadenas simples y se integran en un RISC activo, por el Complejo de Carga de RISC (RLC). El RLC incluye Dicer-2 y R2D2, y es crucial para unir Ago2 y RISC. [ 11 ] El factor 11 asociado a la proteína de unión a TATA (TAF11) ensambla el RLC facilitando la tetramerización de Dcr-2-R2D2, lo que aumenta la afinidad de unión al siRNA en 10 veces. La asociación con TAF11 convertiría el complejo R2-D2-Iniciador (RDI) en el RLC. [ 12 ] R2D2 posee dominios de unión a ARN de doble cadena en tándem para reconocer el extremo termodinámicamente estable de los dúplex de siRNA, mientras que Dicer-2 reconoce el otro extremo menos estable. La carga es asimétrica: el dominio MID de Ago2 reconoce el extremo termodinámicamente estable del siRNA. Por lo tanto, la hebra "pasajera" (sentido) cuyo extremo 5' es descartado por MID es expulsada, mientras que la hebra "guía" (antisentido) conservada coopera con AGO para formar el RISC. [ 11 ]

Tras su integración en el RISC, los siRNA se aparean con su ARNm diana y lo escinden, impidiendo así que se utilice como plantilla de traducción . [ 13 ] A diferencia de los siRNA, un complejo RISC cargado con miRNA explora los ARNm citoplasmáticos en busca de complementariedad potencial. En lugar de la escisión destructiva (por Ago2), los miRNA se dirigen a las regiones 3' no traducidas (UTR) de los ARNm, donde suelen unirse con complementariedad imperfecta, bloqueando así el acceso de los ribosomas para la traducción. [ 14 ]

El ARN bicatenario exógeno es detectado y unido por una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de Dicer. [ 15 ] Se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud y esta proteína solo se une a ARN bicatenarios largos. [ 15 ]

En C. elegans, esta respuesta de iniciación se amplifica mediante la síntesis de una población de siRNAs "secundarios" durante la cual los siRNAs iniciadores o "primarios" producidos por Dicer se utilizan como plantillas. [ 16 ] Estos siRNAs "secundarios" son estructuralmente distintos de los siRNAs producidos por Dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). [ 17 ]

MicroARN

La estructura secundaria de tallo-bucle de un pre- microARN de Brassica oleracea

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente que ayudan a regular la expresión génica , particularmente durante el desarrollo . [ 18 ] El fenómeno de ARNi, definido ampliamente, incluye los efectos de silenciamiento génico inducidos endógenamente por miARN, así como el silenciamiento desencadenado por ARN bicatenario extraño. Los miARN maduros son estructuralmente similares a los siARN producidos a partir de ARN bicatenario exógeno, pero antes de alcanzar la madurez, los miARN deben primero sufrir una extensa modificación postranscripcional . Un miARN se expresa a partir de un gen codificante de ARN mucho más largo como un transcrito primario conocido como pri-miARN que es procesado, en el núcleo celular , a una estructura de tallo-bucle de 70 nucleótidos llamada pre-miARN por el complejo microprocesador . Este complejo consta de una enzima RNasa III llamada Drosha y una proteína de unión a ARN bicatenario DGCR8 . La porción de ARN bicatenario de este pre-miARN se une y escinde por Dicer para producir la molécula de miARN madura que puede integrarse en el complejo RISC; por lo tanto, el miARN y el siARN comparten la misma maquinaria celular posterior. [ 19 ] Primero, se describió el miARN codificado viralmente en el virus de Epstein-Barr (VEB). [ 20 ] Posteriormente, se ha descrito un número creciente de microARN en virus. VIRmiRNA es un catálogo completo que abarca el microARN viral, sus dianas y los miARN antivirales [ 21 ] (véase también el recurso VIRmiRNA: http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/).

Los siRNA derivados de precursores de dsRNA largos difieren de los miRNA en que estos últimos, especialmente en animales, suelen tener un apareamiento de bases incompleto con una diana e inhiben la traducción de muchos ARNm diferentes con secuencias similares. En cambio, los siRNA suelen aparearse perfectamente e inducen la escisión del ARNm solo en una única diana específica. [ 22 ] En Drosophila y C. elegans , los miRNA y siRNA son procesados ​​por proteínas Argonaute y enzimas Dicer distintas. [ 23 ] [ 24 ]

Tres regiones no traducidas principales y microARN

Las regiones 3' no traducidas (3'UTR) de los ARNm suelen contener secuencias reguladoras que inducen la interferencia de ARN (ARNi) postranscripcionalmente. Estas regiones 3'UTR a menudo contienen sitios de unión tanto para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la región 3'UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de diversos ARNm, ya sea inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación del transcrito. La región 3'UTR también puede contener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.

La región 3′-UTR suele contener elementos de respuesta a microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los microARN. Estos son motivos frecuentes en las regiones 3′-UTR. Entre todos los motivos reguladores presentes en las regiones 3′-UTR (incluidas, por ejemplo, las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad.

A partir de 2023, el sitio web miRBase , [ 25 ] un archivo de secuencias y anotaciones de miRNA , enumeraba 28 645 entradas en 271 especies biológicas. De estas, 1917 miRNAs estaban en loci de miRNA humanos anotados. Se predijo que los miRNAs tenían un promedio de alrededor de cuatrocientos ARNm diana (que afectan la expresión de varios cientos de genes). [ 26 ] Friedman et al. [ 26 ] estiman que >45 000 sitios diana de miRNA dentro de las 3′UTR del ARNm humano están conservados por encima de los niveles basales, y >60 % de los genes humanos codificadores de proteínas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con miRNAs.

Los experimentos directos muestran que un solo miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [ 27 ] Otros experimentos muestran que un solo miRNA puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión suele ser relativamente leve (menos de 2 veces). [ 28 ] [ 29 ]

Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miRNA parecen ser importantes en el cáncer. [ 30 ] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve miRNAs que se alteran epigenéticamente y son eficaces en la regulación negativa de las enzimas de reparación del ADN. [ 31 ]

Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miRNA también parecen ser importantes en trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]

Activación y catálisis del complejo RISC

El ARN bicatenario exógeno es detectado y unido por una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de Dicer. [ 15 ] Esta proteína solo se une a ARN bicatenarios largos, pero se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud. [ 15 ] Esta proteína de unión a ARN facilita la transferencia de los siARN escindidos al complejo RISC. [ 35 ]

En C. elegans, esta respuesta de iniciación se amplifica mediante la síntesis de una población de siRNAs "secundarios" durante la cual los siRNAs iniciadores o "primarios" producidos por Dicer se utilizan como plantillas. [ 16 ] Estos siRNAs "secundarios" son estructuralmente distintos de los siRNAs producidos por Dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). [ 17 ]

Izquierda: Proteína Argonaute completa de la especie de arquea Pyrococcus furiosus . Derecha: Dominio PIWI de una proteína Argonaute en complejo con ARN de doble cadena .

Los componentes activos de un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) son endonucleasas llamadas proteínas Argonaute, que escinden la cadena de ARNm diana complementaria a su siRNA unido. [ 6 ] Como los fragmentos producidos por Dicer son de doble cadena, en teoría cada uno podría producir un siRNA funcional. Sin embargo, solo una de las dos cadenas, conocida como cadena guía , se une a Argonaute y dirige el silenciamiento génico. La otra cadena antiguía o cadena pasajera se degrada durante la activación de RISC. [ 36 ] Aunque inicialmente se creyó que una helicasa dependiente de ATP separaba estas dos cadenas, [ 37 ] el proceso resultó ser independiente de ATP y realizado directamente por los componentes proteicos de RISC. [ 3 ] [ 38 ] Sin embargo, un análisis cinético in vitro de ARNi en presencia y ausencia de ATP mostró que el ATP puede ser necesario para desenrollar y eliminar la hebra de ARNm escindida del complejo RISC después de la catálisis. [ 39 ] La hebra guía tiende a ser aquella cuyo extremo 5′ está menos establemente emparejado con su complemento, [ 40 ] pero la selección de la hebra no se ve afectada por la dirección en la que Dicer escinde el ARN bicatenario antes de la incorporación al RISC. [ 41 ] En cambio, la proteína R2D2 puede servir como factor diferenciador al unirse al extremo 5′ más estable de la hebra pasajera. [ 42 ]

La base estructural para la unión del ARN a la proteína Argonaute se examinó mediante cristalografía de rayos X del dominio de unión de un Argonaute unido al ARN. Aquí, el extremo 5′ fosforilado de la cadena de ARN entra en un bolsillo de superficie básico conservado y establece contactos a través de un catión divalente (un átomo con dos cargas positivas) como el magnesio y por apilamiento aromático (un proceso que permite que más de un átomo comparta un electrón pasándolo de un lado a otro) entre el nucleótido 5′ en el siRNA y un residuo de tirosina conservado . Se cree que este sitio forma un sitio de nucleación para la unión del siRNA a su ARNm diana. [ 43 ] El análisis del efecto inhibidor de los desajustes en el extremo 5' o 3' de la cadena guía ha demostrado que el extremo 5' de la cadena guía es probablemente responsable del emparejamiento y la unión al ARNm diana, mientras que el extremo 3' es responsable de organizar físicamente el ARNm diana en una región RISC favorable a la escisión. [ 39 ]

No se comprende cómo el complejo RISC activado localiza los ARNm complementarios dentro de la célula. Aunque se ha propuesto que el proceso de escisión está vinculado a la traducción , la traducción del ARNm diana no es esencial para la degradación mediada por ARNi. [ 44 ] De hecho, el ARNi puede ser más eficaz contra los ARNm diana que no se traducen. [ 45 ] Las proteínas Argonaute se localizan en regiones específicas del citoplasma llamadas cuerpos P (también cuerpos citoplasmáticos o cuerpos GW), que son regiones con altas tasas de degradación de ARNm; [ 46 ] La actividad de los microARN también se agrupa en los cuerpos P. [ 47 ] La alteración de los cuerpos P disminuye la eficiencia del ARNi, lo que sugiere que son un sitio crítico en el proceso de ARNi. [ 48 ]

silenciamiento transcripcional

La enzima Dicer recorta el ARN de doble cadena para formar ARN de interferencia pequeño o microARN . Estos ARN procesados ​​se incorporan al complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que actúa sobre el ARN mensajero para impedir su traducción . [ 49 ]

Los componentes de la vía de ARN de interferencia (ARNi) se utilizan en muchos eucariotas para el mantenimiento de la organización y estructura de sus genomas . La modificación de las histonas y la inducción asociada de la formación de heterocromatina sirven para regular negativamente los genes pretranscripcionalmente ; [ 50 ] este proceso se denomina silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS) y es llevado a cabo por un complejo de proteínas llamado complejo RITS. En la levadura de fisión, este complejo contiene Argonaute, una proteína cromodominio Chp1 y una proteína llamada Tas3 de función desconocida. [ 51 ] Como consecuencia, la inducción y propagación de regiones heterocromáticas requiere las proteínas Argonaute y RdRP. [ 52 ] De hecho, la eliminación de estos genes en la levadura de fisión S. pombe interrumpe la metilación de las histonas y la formación del centrómero , [ 53 ] causando una anafase lenta o detenida durante la división celular . [ 54 ] En algunos casos, se han observado procesos similares asociados con la modificación de histonas que regulan positivamente la transcripción de genes. [ 55 ]

El mecanismo por el cual el complejo RITS induce la formación y organización de la heterocromatina no se comprende bien. La mayoría de los estudios se han centrado en la región del tipo de apareamiento en la levadura de fisión, que puede no ser representativa de las actividades en otras regiones genómicas/organismos. En el mantenimiento de las regiones de heterocromatina existentes, RITS forma un complejo con siRNAs complementarios a los genes locales y se une de forma estable a las histonas metiladas locales, actuando cotranscripcionalmente para degradar cualquier transcrito de pre-ARNm naciente que sea iniciado por la ARN polimerasa . La formación de dicha región de heterocromatina, aunque no su mantenimiento, es dependiente de Dicer, presumiblemente porque Dicer es necesario para generar el complemento inicial de siRNAs que se dirigen a los transcritos subsiguientes. [ 56 ] Se ha sugerido que el mantenimiento de la heterocromatina funciona como un bucle de retroalimentación autorrefuerzo, ya que se forman nuevos siRNAs a partir de los transcritos nacientes ocasionales por RdRP para su incorporación en los complejos RITS locales. [ 57 ] La relevancia de las observaciones de las regiones de tipo de apareamiento y los centrómeros de la levadura de fisión para los mamíferos no está clara, ya que el mantenimiento de la heterocromatina en las células de mamíferos puede ser independiente de los componentes de la vía de ARN de interferencia. [ 58 ]

Interacción con la edición de ARN

El tipo de edición de ARN más frecuente en eucariotas superiores convierte los nucleótidos de adenosina en inosina en los ARN bicatenarios mediante la enzima adenosina desaminasa (ADAR). [ 59 ] En el año 2000 se propuso originalmente que las vías de ARN de interferencia (ARNi) y de edición de ARN A→I podrían competir por un sustrato común de ARN bicatenario. [ 60 ] Algunos pre-miARN experimentan edición de ARN A→I [ 61 ] [ 62 ] y este mecanismo puede regular el procesamiento y la expresión de los miARN maduros. [ 62 ] Además, al menos una ADAR de mamíferos puede secuestrar siARN de los componentes de la vía de ARNi. [ 63 ] Este modelo recibe más apoyo de estudios en cepas de C. elegans deficientes en ADAR, que indican que la edición de ARN A→I puede contrarrestar el silenciamiento por ARNi de genes endógenos y transgenes. [ 64 ]

Ilustración de las principales diferencias entre el silenciamiento génico en plantas y animales. El microARN expresado de forma natural o el siRNA exógeno es procesado por Dicer e integrado en el complejo RISC , que media el silenciamiento génico. [ 65 ]

Variación entre organismos

Los organismos varían en su capacidad para captar ARN bicatenario extraño y utilizarlo en la vía de ARN de interferencia (ARNi). Los efectos del ARNi pueden ser sistémicos y hereditarios en plantas y C. elegans , aunque no en Drosophila ni en mamíferos. En las plantas, se cree que el ARNi se propaga mediante la transferencia de ARN pequeños de interferencia (siRNA) entre células a través de plasmodesmos (canales en las paredes celulares que permiten la comunicación y el transporte). [ 37 ] La heredabilidad proviene de la metilación de los promotores a los que se dirige el ARNi; el nuevo patrón de metilación se copia en cada nueva generación de la célula. [ 66 ] Una distinción general amplia entre plantas y animales radica en la focalización de los microARN (miRNA) producidos endógenamente; en las plantas, los miRNA suelen ser perfectamente o casi perfectamente complementarios a sus genes diana e inducen la escisión directa del ARNm por RISC, mientras que los miRNA de los animales tienden a ser más divergentes en secuencia e inducen la represión traslacional. [ 65 ] Este efecto traslacional puede producirse al inhibir las interacciones de los factores de iniciación de la traducción con la cola de poliadenina del ARNm . [ 67 ]

Algunos protozoos eucariotas como Leishmania major y Trypanosoma cruzi carecen por completo de la vía de ARN de interferencia (ARNi). [ 68 ] [ 69 ] La mayoría o la totalidad de los componentes también faltan en algunos hongos , en particular en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae . [ 70 ] La presencia de ARNi en otras especies de levaduras en gemación como Saccharomyces castellii y Candida albicans demuestra además que la inducción de dos proteínas relacionadas con el ARNi de S. castellii facilita el ARNi en S. cerevisiae . [ 71 ] Que ciertos ascomicetos y basidiomicetos carezcan de vías de ARNi indica que las proteínas necesarias para el silenciamiento del ARN se han perdido independientemente de muchos linajes fúngicos , posiblemente debido a la evolución de una vía novedosa con una función similar, o a la falta de ventaja selectiva en ciertos nichos . [ 72 ]

La expresión génica en procariotas está influenciada por un sistema basado en ARN similar en algunos aspectos a la interferencia de ARN (ARNi). En este caso, los genes que codifican ARN controlan la abundancia o la traducción del ARNm mediante la producción de un ARN complementario que se une a un ARNm. Sin embargo, estos ARN reguladores no se consideran generalmente análogos a los microARN (miARN) porque la enzima Dicer no está involucrada. [ 73 ] Se ha sugerido que los sistemas de interferencia CRISPR en procariotas son análogos a los sistemas de ARNi eucariotas, aunque ninguno de los componentes proteicos es ortólogo . [ 74 ]

Funciones biológicas

Inmunidad

El ARN de interferencia (ARNi) es una parte vital de la respuesta inmune a los virus y otros materiales genéticos extraños , especialmente en plantas donde también puede prevenir la autopropagación de transposones. [ 75 ] Plantas como Arabidopsis thaliana expresan múltiples homólogos de Dicer que están especializados para reaccionar de manera diferente cuando la planta se expone a diferentes virus. [ 76 ] Incluso antes de que se comprendiera completamente la vía del ARNi, se sabía que el silenciamiento génico inducido en plantas podía propagarse por toda la planta en un efecto sistémico y podía transferirse de plantas patrón a plantas injertadas a través del injerto . [ 77 ] Este fenómeno se ha reconocido desde entonces como una característica del sistema inmunitario de las plantas que permite que toda la planta responda a un virus después de un encuentro localizado inicial. [ 78 ] En respuesta, muchos virus de plantas han desarrollado mecanismos elaborados para suprimir la respuesta del ARNi. [ 79 ] Estos incluyen proteínas virales que se unen a fragmentos cortos de ARN de doble cadena con extremos de cadena simple sobresalientes, como los producidos por Dicer. [ 80 ] Algunos genomas de plantas también expresan siRNAs endógenos en respuesta a la infección por tipos específicos de bacterias . [ 81 ] Estos efectos pueden ser parte de una respuesta generalizada a los patógenos que regula negativamente cualquier proceso metabólico en el huésped que ayude al proceso de infección. [ 82 ]

Aunque los animales generalmente expresan menos variantes de la enzima Dicer que las plantas, el ARN de interferencia (ARNi) en algunos animales produce una respuesta antiviral. Tanto en Drosophila juvenil como adulta , el ARNi es importante en la inmunidad innata antiviral y es activo contra patógenos como el virus X de Drosophila . [ 83 ] [ 84 ] Un papel similar en la inmunidad podría operar en C. elegans , ya que las proteínas Argonaute se regulan positivamente en respuesta a virus y los gusanos que sobreexpresan componentes de la vía del ARNi son resistentes a la infección viral. [ 85 ] [ 86 ]

El papel del ARN de interferencia (ARNi) en la inmunidad innata de los mamíferos es poco conocido y se dispone de relativamente pocos datos. Sin embargo, la existencia de virus que codifican genes capaces de suprimir la respuesta del ARNi en células de mamíferos podría ser evidencia a favor de una respuesta inmune de mamíferos dependiente del ARNi, [ 87 ] [ 88 ] aunque esta hipótesis ha sido cuestionada por estar poco fundamentada. [ 89 ] Se ha presentado evidencia de la existencia de una vía funcional de ARNi antiviral en células de mamíferos. [ 90 ] [ 91 ]

También existen otras funciones para el ARN de interferencia en los virus de mamíferos, como los microARN expresados ​​por el virus del herpes que pueden actuar como desencadenantes de la organización de la heterocromatina para mediar la latencia viral. [ 92 ]

Regulación negativa de los genes

Los miRNA expresados ​​endógenamente, incluidos los miRNA intrónicos e intergénicos , son de suma importancia en la represión traslacional [ 65 ] y en la regulación del desarrollo, especialmente en el momento de la morfogénesis y el mantenimiento de tipos celulares indiferenciados o incompletamente diferenciados, como las células madre . [ 93 ] El papel de los miRNA expresados ​​endógenamente en la regulación negativa de la expresión génica se describió por primera vez en C. elegans en 1993. [ 94 ] En las plantas, esta función se descubrió cuando se demostró que el "microARN JAW" de Arabidopsis participaba en la regulación de varios genes que controlan la forma de la planta. [ 95 ] En las plantas, la mayoría de los genes regulados por miRNA son factores de transcripción ; [ 96 ] por lo tanto, la actividad de los miRNA es particularmente amplia y regula redes génicas completas durante el desarrollo al modular la expresión de genes reguladores clave, incluidos factores de transcripción y proteínas F-box . [ 97 ] En muchos organismos, incluidos los humanos, los miRNAs están vinculados a la formación de tumores y a la desregulación del ciclo celular . Aquí, los miRNAs pueden funcionar como oncogenes y supresores tumorales . [ 98 ]

Evolución

Según el análisis filogenético basado en la parsimonia , el ancestro común más reciente de todos los eucariotas probablemente ya poseía una vía de ARN de interferencia temprana; se cree que la ausencia de esta vía en ciertos eucariotas es una característica derivada. [ 99 ] Este sistema ancestral de ARN de interferencia probablemente contenía al menos una proteína similar a Dicer, una proteína Argonaute, una proteína PIWI y una ARN polimerasa dependiente de ARN que también podría haber desempeñado otras funciones celulares. Un estudio de genómica comparativa a gran escala también indica que el grupo corona eucariota ya poseía estos componentes, los cuales podrían haber tenido asociaciones funcionales más estrechas con sistemas generalizados de degradación de ARN como el exosoma . [ 100 ] Este estudio también sugiere que la familia de proteínas Argonaute de unión a ARN, que se comparte entre eucariotas, la mayoría de las arqueas y al menos algunas bacterias (como Aquifex aeolicus ), es homóloga a componentes del sistema de iniciación de la traducción y evolucionó originalmente a partir de ellos .

Aplicaciones

Vía de ARN de interferencia para la supresión génica

La supresión génica es un método utilizado para reducir la expresión de genes específicos de un organismo. Esto se logra mediante el proceso natural de ARN de interferencia (ARNi). [ 6 ] Esta técnica de supresión génica utiliza una molécula de ARNip de doble cadena sintetizada con una secuencia complementaria al gen de interés. La cascada de ARNi comienza cuando la enzima Dicer empieza a procesar el ARNip. El resultado final del proceso conduce a la degradación del ARNm y destruye las instrucciones necesarias para la síntesis de ciertas proteínas. Mediante este método, los investigadores pueden disminuir (pero no eliminar por completo) la expresión de un gen específico. El estudio de los efectos de esta disminución en la expresión puede revelar la función o el impacto fisiológico de los productos del gen diana. [ 101 ] [ 102 ]

Efectos no deseados de la inactivación génica

Se han realizado grandes esfuerzos en biología computacional para diseñar reactivos de dsRNA eficaces que maximicen la supresión génica y minimicen los efectos "fuera de objetivo". Los efectos fuera de objetivo surgen cuando un ARN introducido tiene una secuencia de bases que puede emparejarse con múltiples genes y, por lo tanto, reducir su expresión. Estos problemas ocurren con mayor frecuencia cuando el dsRNA contiene secuencias repetitivas. Se ha estimado, a partir del estudio de los genomas de humanos, C. elegans y S. pombe , que alrededor del 10 % de los posibles siRNA tienen efectos fuera de objetivo sustanciales. [ 10 ] Se han desarrollado multitud de herramientas de software que implementan algoritmos para el diseño de siRNA generales [ 103 ] [ 104 ] específicos de mamíferos, [ 105 ] y específicos de virus [ 106 ] que se comprueban automáticamente para detectar posibles reactividades cruzadas.

Dependiendo del organismo y del sistema experimental, el ARN exógeno puede ser una cadena larga diseñada para ser escindida por Dicer, o ARN cortos diseñados para servir como sustratos de siRNA. En la mayoría de las células de mamíferos, se utilizan ARN más cortos porque las moléculas largas de ARN de doble cadena inducen la respuesta de interferón de los mamíferos , una forma de inmunidad innata que reacciona de forma no específica al material genético extraño. [ 107 ] Los ovocitos de ratón y las células de embriones tempranos de ratón carecen de esta reacción al dsRNA exógeno y, por lo tanto, son un sistema modelo común para estudiar los efectos de la inactivación génica en mamíferos. [ 108 ] También se han desarrollado técnicas de laboratorio especializadas para mejorar la utilidad del ARNi en sistemas de mamíferos evitando la introducción directa de siRNA, por ejemplo, mediante la transfección estable con un plásmido que codifica la secuencia apropiada a partir de la cual se pueden transcribir los siRNA, [ 109 ] o mediante sistemas de vectores lentivirales más elaborados que permiten la activación o desactivación inducible de la transcripción, conocida como ARNi condicional . [ 110 ] [ 111 ]

Medicamento

Medicamentos

Una mosca Drosophila adulta normal , un organismo modelo común utilizado en experimentos de ARN de interferencia (ARNi).
Cronología del uso del ARN de interferencia (ARNi) en medicina entre 1996 y 2017.

La técnica de silenciamiento génico mediante terapias de ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado su eficacia en estudios clínicos controlados aleatorizados. Estos fármacos constituyen una clase creciente de medicamentos basados ​​en ARNip que disminuyen la expresión de proteínas codificadas por ciertos genes. Hasta la fecha, cinco fármacos de ARNi han sido aprobados por las autoridades reguladoras de EE. UU. y Europa: patisiran (2018), givosiran (2019), lumasiran (2020), inclisiran (2020 en Europa, con aprobación prevista en EE. UU. en 2021) y vutrisiran (2022). [ 112 ] [ 113 ] [ 114 ] [ 115 ]

Si bien todas las terapias de ARN de interferencia (ARNi) aprobadas actualmente por los organismos reguladores se centran en enfermedades que se originan en el hígado, otros medicamentos en investigación se dirigen a una gran variedad de enfermedades, incluidas las cardiovasculares, los trastornos hemorrágicos, los trastornos por consumo de alcohol, la fibrosis quística, la gota, el carcinoma y las enfermedades oculares.

Patisiran es el primer medicamento basado en siRNA de doble cadena aprobado en 2018 y desarrollado por Alnylam Pharmaceuticals . Patisiran utiliza la cascada de ARN de interferencia (ARNi) para suprimir el gen que codifica la transtiretina (TTR). Las mutaciones en este gen pueden causar el plegamiento incorrecto de una proteína responsable de la amiloidosis hereditaria por transtiretina (ATTR) . Para lograr una respuesta terapéutica, patisiran está encapsulado por una membrana de nanopartículas lipídicas que facilita su paso al citoplasma. Una vez dentro de la célula, el siRNA comienza a ser procesado por la enzima Dicer. Patisiran es administrado por un profesional de la salud mediante infusión intravenosa, con una dosificación basada en el peso corporal. Las advertencias y precauciones incluyen el riesgo de reacciones relacionadas con la infusión y la disminución de los niveles de vitamina A (en suero). [ 116 ]

En 2019, la FDA y la EMA aprobaron givosiran para el tratamiento de adultos con porfiria hepática aguda (PHA). [ 117 ] La FDA también otorgó a givosiran la designación de terapia innovadora , la designación de revisión prioritaria y la designación de medicamento huérfano para el tratamiento de la porfiria hepática aguda (PHA) en noviembre de 2019. [ 118 ] Para 2020, givosiran recibió la aprobación de la EMA. [ 119 ] Givosiran es un siRNA que degrada el ARNm de la aminolevulinato sintasa 1 (ALAS1) en el hígado. La degradación del ARNm de ALAS1 previene la acumulación de toxinas (responsables de ataques neuroviscerales y enfermedad de PHA) como el ácido aminolevulínico (ALA) y el porfobilinógeno (PBG). [ 120 ] [ 121 ] [ 122 ] [ 123 ] Para facilitar su entrada al citoplasma, givosiran utiliza ligandos de GalNAc y penetra en las células hepáticas. El medicamento es administrado por vía subcutánea por un profesional sanitario con una dosificación basada en el peso corporal. Las advertencias y precauciones incluyen el riesgo de reacciones anafilácticas, toxicidad hepática, toxicidad renal y reacciones en el lugar de la inyección. [ 124 ]

Lumasiran fue aprobado como medicamento basado en siRNA en 2020 para su uso tanto en la Unión Europea como en los Estados Unidos. [ 125 ] [ 126 ] Este medicamento se utiliza para el tratamiento de la hiperoxaluria primaria tipo 1 (PH1) en poblaciones pediátricas y adultas. El fármaco está diseñado para reducir la producción hepática de oxalato y los niveles urinarios de oxalato a través de RNAi, dirigiéndose al ARNm de la hidroxiácido oxidasa 1 (HAO1) ​​para su degradación. La disminución de los niveles de la enzima HAO1 reduce la oxidación del glicolato a glioxilato (que es un sustrato del oxalato). Lumasiran es administrado por vía subcutánea por un profesional sanitario con una dosificación basada en el peso corporal. [ 127 ] Los datos de ensayos clínicos controlados aleatorizados indican que la reacción adversa más común notificada fueron las reacciones en el lugar de la inyección. Estas reacciones fueron leves y se presentaron en el 38 por ciento de los pacientes tratados con lumasiran. [ 128 ]

En 2022, la FDA y la EMA aprobaron vutrisiran para el tratamiento de adultos con amiloidosis hereditaria mediada por transtiretina con polineuropatía en estadio 1 o 2. [ 129 ] [ 130 ] Vutrisiran está diseñado para descomponer el ARNm que codifica la transtiretina .

Otras compañías farmacéuticas, como Arrowhead Pharmaceuticals , Dicerna, Alnylam Pharmaceuticals , Amgen y Sylentis, están desarrollando fármacos en fase de investigación que utilizan ARN de interferencia (ARNi). Estos medicamentos actúan sobre diversos objetivos y enfermedades mediante el ARNi.

Terapias experimentales de ARN de interferencia en desarrollo:

Actualmente, tanto el miRNA como el siRNA se sintetizan químicamente y, por lo tanto, se clasifican legalmente en la UE y en EE. UU. como medicamentos "simples". Sin embargo, dado que el siRNA bioingenierizado (BERA) se encuentra en desarrollo, se clasificaría como medicamento biológico, al menos en la UE. El desarrollo de la tecnología BERA plantea la cuestión de la clasificación de fármacos con el mismo mecanismo de acción, pero producidos química o biológicamente. Esta falta de coherencia debe abordarse. [ 131 ]

Mecanismos de entrega

Para alcanzar el potencial clínico de la RNAi, el siRNA debe transportarse eficientemente a las células de los tejidos diana. Sin embargo, existen varias barreras que deben superarse antes de su uso clínico. Por ejemplo, el siRNA "desnudo" es susceptible a diversos obstáculos que reducen su eficacia terapéutica. [ 132 ] Además, una vez que el siRNA ha entrado en el torrente sanguíneo, el ARN desnudo puede ser degradado por las nucleasas séricas y estimular el sistema inmunitario innato. [ 132 ] Debido a su tamaño y naturaleza altamente polianiónica (contiene cargas negativas en varios sitios), las moléculas de siRNA no modificadas no pueden entrar fácilmente en las células a través de la membrana celular. Por lo tanto, debe utilizarse siRNA artificial o encapsulado en nanopartículas . Si el siRNA se transfiere a través de la membrana celular, pueden producirse toxicidades no deseadas si las dosis terapéuticas no están optimizadas, y los siRNA pueden presentar efectos fuera de objetivo (por ejemplo, regulación negativa no deseada de genes con complementariedad de secuencia parcial ). [ 133 ] Incluso después de entrar en las células, se requiere una dosificación repetida, ya que sus efectos se diluyen en cada división celular. En respuesta a estos posibles problemas y barreras, dos enfoques ayudan a facilitar la administración de siRNA a las células diana: nanopartículas lipídicas y conjugados. [ 134 ]

nanopartículas lipídicas

Las nanopartículas lipídicas (LNP) se basan en estructuras similares a liposomas que generalmente constan de un núcleo acuoso rodeado por una capa lipídica. [ 135 ] Un subconjunto de estructuras liposomales utilizadas para la administración de fármacos a los tejidos se encuentra en grandes vesículas unilamelares (LUV) que pueden tener un tamaño de 100  nm. Los mecanismos de administración de LNP se han convertido en una fuente cada vez mayor de ácidos nucleicos encapsulados y pueden incluir plásmidos , CRISPR y ARNm . [ 136 ]

El primer uso aprobado de nanopartículas lipídicas como mecanismo de administración de fármacos comenzó en 2018 con el fármaco de ARNip patisiran, desarrollado por Alnylam Pharmaceuticals. Dicerna Pharmaceuticals, Persomics , Sanofi y Sirna Therapeutics también trabajaron para comercializar terapias de ARN de interferencia (ARNi). [ 137 ] [ 138 ]

Otras aplicaciones recientes incluyen dos vacunas contra la COVID-19 aprobadas por la FDA: mRNA-1273, desarrollada por Moderna , y BNT162b , desarrollada mediante una colaboración entre Pfizer y BioNTech . [ 139 ] Estas dos vacunas utilizan nanopartículas lipídicas para administrar el ARNm del antígeno. Encapsular la molécula de ARNm en nanopartículas lipídicas fue un avance crucial para producir vacunas de ARNm viables, resolviendo varias barreras técnicas clave en la administración de la molécula de ARNm a la célula huésped, distribuida a través de la apolipoproteína E (apoE) en el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR). En diciembre de 2020, Novartis anunció que los resultados positivos de los estudios de eficacia de fase III consideraron a inclisirán como un tratamiento para la hipercolesterolemia familiar heterocigótica (HeFH) y la enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ASCVD). [ 140 ]

Conjugados

Además de las LNP, las terapias de ARN de interferencia (ARNi) cuentan con administración dirigida mediante conjugados de ARNip (p. ej., GalNAc, carbohidratos, péptidos, aptámeros, anticuerpos). [ 141 ] Se han desarrollado terapias con conjugados de ARNip para enfermedades raras o genéticas como la porfiria hepática aguda (PHA), la hemofilia , la hiperoxaluria primaria (HP) y la amiloidosis hereditaria ATTR, así como otras enfermedades cardiometabólicas como la hipertensión y la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). [ 142 ]

Infección viral

El tratamiento antiviral es una de las primeras aplicaciones médicas basadas en ARNi propuestas, y se han desarrollado dos tipos diferentes. El primer tipo es dirigirse a los ARN virales. Muchos estudios han demostrado que dirigirse a los ARN virales puede suprimir la replicación de numerosos virus, incluidos el VIH , [ 143 ] VPH , [ 144 ] hepatitis A , [ 145 ] hepatitis B , [ 146 ] virus de la influenza , [ 147 ] [ 148 ] [ 149 ] [ 150 ] virus sincitial respiratorio (VSR), [ 150 ] coronavirus del SARS (SARS-CoV), [ 150 ] adenovirus [ 150 ] y virus del sarampión . [ 151 ] La otra estrategia es bloquear las entradas virales iniciales dirigiéndose a los genes de la célula huésped. [ 152 ] Por ejemplo, la supresión de los receptores de quimiocinas ( CXCR4 y CCR5 ) en las células huésped puede prevenir la entrada del virus VIH. [ 153 ]

Cáncer

Si bien la quimioterapia tradicional puede eliminar eficazmente las células cancerosas, la falta de especificidad para diferenciar entre células normales y cancerosas en estos tratamientos suele causar efectos secundarios graves. Numerosos estudios han demostrado que el ARN de interferencia (ARNi) puede proporcionar un enfoque más específico para inhibir el crecimiento tumoral al dirigirse a genes relacionados con el cáncer (es decir, oncogenes ). [ 154 ] También se ha propuesto que el ARNi puede aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos , proporcionando un enfoque terapéutico combinado con la quimioterapia. [ 155 ] Otro posible tratamiento basado en ARNi es la inhibición de la invasión y migración celular . [ 156 ]

En comparación con la quimioterapia u otros fármacos anticancerígenos, el fármaco siRNA presenta muchas ventajas. [ 157 ] El siRNA actúa en la etapa postranscripcional de la expresión génica, por lo que no modifica ni altera el ADN de forma perjudicial. [ 157 ] El siRNA también puede utilizarse para producir una respuesta específica de una manera determinada, como por ejemplo, reduciendo la supresión de la expresión génica. [ 157 ] En una sola célula cancerosa, el siRNA puede causar una supresión drástica de la expresión génica con tan solo unas pocas copias. [ 157 ] Esto se logra silenciando genes promotores del cáncer mediante ARN de interferencia (ARNi), así como dirigiéndose a una secuencia de ARNm. [ 157 ]

Los fármacos de ARN de interferencia (ARNi) tratan el cáncer silenciando ciertos genes que lo promueven. [ 157 ] Esto se logra complementando los genes cancerígenos con el ARNi, por ejemplo, manteniendo las secuencias de ARNm de acuerdo con el fármaco de ARNi. [ 157 ] Idealmente, el ARNi debería inyectarse y/o modificarse químicamente para que pueda llegar a las células cancerosas de manera más eficiente. [ 157 ] La ​​captación y regulación del ARNi están controladas por los riñones. [ 157 ]

Enfermedades neurológicas

Las estrategias de ARN de interferencia (ARNi) también muestran potencial para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas . Estudios en células y en ratones han demostrado que la inhibición específica de genes productores de beta-amiloide (por ejemplo, BACE1 y APP) mediante ARNi puede reducir significativamente la cantidad de péptido Aβ, lo cual se correlaciona con la causa de la enfermedad de Alzheimer . [ 158 ] [ 159 ] [ 160 ] Además, estos enfoques basados ​​en el silenciamiento también proporcionan resultados prometedores en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad por poliglutamina . [ 161 ] [ 162 ] [ 163 ]

Estimulación de la respuesta inmune

El sistema inmunitario humano se divide en dos ramas distintas: el sistema inmunitario innato y el sistema inmunitario adaptativo. [ 164 ] El sistema inmunitario innato es la primera línea de defensa contra las infecciones y responde a los patógenos de forma genérica. [ 164 ] Por otro lado, el sistema inmunitario adaptativo, que evolucionó posteriormente al innato, está compuesto principalmente por células B y T altamente especializadas, entrenadas para reaccionar ante porciones específicas de moléculas patógenas. [ 164 ]

El desafío entre patógenos antiguos y nuevos ha contribuido a la creación de un sistema de células y partículas protegidas, denominado marco de seguridad. [ 164 ] Este marco ha dotado a los humanos de un ejército de sistemas que buscan y destruyen partículas invasoras, como patógenos, microorganismos, parásitos e infecciones. [ 164 ] El marco de seguridad de los mamíferos se ha desarrollado para incorporar el ARNip como herramienta para detectar infecciones virales, lo que ha permitido que el ARNip genere una intensa respuesta inmunitaria innata. [ 164 ]

El siRNA está controlado por el sistema inmunitario innato, que se puede dividir en respuestas inflamatorias agudas y respuestas antivirales. [ 164 ] La respuesta inflamatoria se crea con señales de pequeñas moléculas de señalización, o citocinas. [ 164 ] Estas incluyen interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α). [ 164 ] El sistema inmunitario innato genera inflamación y respuestas antivirales, que causan la liberación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). [ 164 ] Estos receptores ayudan a etiquetar qué patógenos son virus, hongos o bacterias. [ 164 ] Además, la importancia del siRNA y el sistema inmunitario innato es incluir más PRR para ayudar a reconocer diferentes estructuras de ARN. [ 164 ] Esto hace que sea más probable que el siRNA cause una respuesta inmunoestimulante en caso de patógeno. [ 164 ]

Biotecnología agrícola

El ARN de interferencia (ARNi) se ha utilizado en diversas aplicaciones agrícolas, incluyendo cultivos modificados genéticamente e insecticidas. El uso de la vía del ARNi ha permitido el desarrollo de numerosos productos, como alimentos como las manzanas árticas , tabaco sin nicotina, café descafeinado, vegetación enriquecida con nutrientes y cultivos hipoalergénicos. [ 165 ] [ 166 ] [ 167 ] El uso emergente del ARNi tiene el potencial de desarrollar muchos otros productos para uso futuro.

cultivos modificados genéticamente

El ARN de interferencia (ARNi) se ha utilizado para modificar genéticamente plantas y lograr niveles más bajos de toxinas vegetales naturales. Estas técnicas aprovechan el fenotipo estable y heredable del ARNi en las líneas vegetales. Las semillas de algodón son ricas en proteínas , pero contienen de forma natural el terpenoide tóxico gosipol , lo que las hace inadecuadas para el consumo humano. El ARNi se ha utilizado para producir líneas de algodón cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintasa , una enzima clave en la producción de gosipol, sin afectar la producción de esta enzima en otras partes de la planta, donde el gosipol es importante para prevenir los daños causados ​​por las plagas. [ 168 ]

Los esfuerzos de desarrollo han reducido con éxito los niveles de alérgenos en plantas de tomate [ 169 ] y la fortificación de plantas como los tomates con antioxidantes dietéticos . [ 170 ] El silenciamiento de la alfa-amilasa mediante ARNi también se ha utilizado para disminuir el crecimiento del hongo Aspergillus flavus en el maíz, que de otro modo habría contaminado los granos con aflatoxinas peligrosas . [ 171 ] El silenciamiento de la sintasa del factor lacrimógeno en cebollas ha producido cebollas sin lágrimas, y el ARNi se ha utilizado en genes BP1 en semillas de colza para mejorar la fotosíntesis. [ 172 ] Los genes SBEIIa y SBEIIb en el trigo se han dirigido al trigo para producir niveles más altos de amilosa para mejorar la función intestinal, [ 173 ] y Travella et al. En 2006 se empleó ARN de interferencia (ARNi) para la genómica funcional en una investigación de razas de pan hexaploides , mientras que Scofield et al. en 2005 utilizaron el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS, un subtipo de ARNi) para investigar el mecanismo de resistencia proporcionado por Lr21 contra la roya de la hoja del trigo en trigo hexaploide . [ 174 ]

Insecticidas

El ARN de interferencia (ARNi) se está desarrollando como insecticida , empleando múltiples enfoques, incluyendo ingeniería genética y aplicación tópica. [ 4 ] Las células del intestino medio de algunos insectos absorben las moléculas de ARN bicatenario en el proceso conocido como ARNi ambiental. [ 175 ] En algunos insectos, el efecto es sistémico, ya que la señal se propaga por todo el cuerpo del insecto (conocido como ARNi sistémico). [ 176 ]

Los animales expuestos a ARNi en dosis millones de veces superiores a los niveles de exposición humana previstos no muestran efectos adversos. [ 177 ] El ARNi tiene efectos variables en diferentes especies de lepidópteros (mariposas y polillas). [ 178 ]

Drosophila spp., Bombyx mori , Locusta spp., Spodoptera spp., Tribolium castaneum , Nilaparvata lugens , Helicoverpa armigera y Apis mellifera son modelos que se han utilizado ampliamente para aprender cómo funciona el ARNi dentro de taxones particulares de insectos. Musca domestica tiene dosgenes Ago2 y Glossina morsitans tres, como encontraron Lewis et al. 2016 y Hain et al. 2010. [ 179 ] [ 180 ] En el caso de lavía del miRNA Diuraphis noxia tiene dos Ago1 , M. domestica dos Dcr1 , Acyrthosiphon pisum dos cada uno de Ago1 y Loqs y Dcr1 y cuatro de Pasha . Mientras que en el piRNA , G. morsitans y A. pisum tienen dos o tres Ago3 cada uno. [ 180 ] Esto ha llevado a la identificación de objetivos futuros para el desarrollo de insecticidas , y los modos de acción y razones de la resistencia a otros insecticidas. [ 180 ]

plantas transgénicas

Se han creado cultivos transgénicos para expresar ARN bicatenario (dsRNA), cuidadosamente seleccionado para silenciar genes cruciales en las plagas objetivo. Estos dsRNA están diseñados para afectar únicamente a los insectos que expresan secuencias genéticas específicas. Como prueba de concepto , en 2009 un estudio demostró que los ARN podían matar a cualquiera de las cuatro especies de mosca de la fruta sin dañar a las otras tres. [ 4 ]

Actual

Como alternativa, el ARN bicatenario (dsRNA) puede suministrarse sin ingeniería genética. Un método consiste en añadirlo al agua de riego . Las moléculas se absorben en el sistema vascular de las plantas y envenenan a los insectos que se alimentan de ellas. Otro método consiste en pulverizar el dsRNA como un pesticida convencional. Esto permitiría una adaptación más rápida a la resistencia. Dichos métodos requerirían fuentes de dsRNA de bajo coste que actualmente no existen. [ 4 ]

Genómica funcional

Los enfoques para el diseño de bibliotecas de ARN de interferencia (ARNi) a escala genómica pueden requerir mayor sofisticación que el diseño de un único ARNip para un conjunto definido de condiciones experimentales. Las redes neuronales artificiales se utilizan frecuentemente para diseñar bibliotecas de ARNip [ 181 ] y para predecir su probable eficiencia en la supresión génica. [ 182 ] El cribado genómico masivo se considera un método prometedor para la anotación del genoma y ha impulsado el desarrollo de métodos de cribado de alto rendimiento basados ​​en microarrays . [ 183 ] ​​[ 184 ]

Cribado a escala genómica

La investigación de ARN de interferencia (ARNi) a escala genómica se basa en la tecnología de cribado de alto rendimiento (HTS). La tecnología HTS de ARNi permite el cribado de pérdida de función en todo el genoma y se utiliza ampliamente en la identificación de genes asociados con fenotipos específicos. Esta tecnología ha sido aclamada como una posible segunda ola genómica, tras la primera ola genómica de microarrays de expresión génica y plataformas de descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido . [ 185 ] Una de las principales ventajas del cribado de ARNi a escala genómica es su capacidad para interrogar simultáneamente miles de genes. Gracias a la capacidad de generar una gran cantidad de datos por experimento, el cribado de ARNi a escala genómica ha dado lugar a una explosión en las tasas de generación de datos. Aprovechar estos grandes conjuntos de datos es un desafío fundamental que requiere métodos estadísticos/bioinformáticos adecuados. El proceso básico del cribado de ARNi basado en células incluye la elección de una biblioteca de ARNi, tipos de células robustos y estables, la transfección con agentes de ARNi, el tratamiento/incubación, la detección de señales, el análisis y la identificación de genes importantes o dianas terapéuticas. [ 186 ]

Historia

descubrimiento de ARN de interferencia

Ejemplo de plantas de petunia en las que los genes de pigmentación se silencian mediante ARN de interferencia (ARNi). La planta de la izquierda es de tipo silvestre ; las plantas de la derecha contienen transgenes que inducen la supresión de la expresión tanto del transgén como del gen endógeno, dando lugar a las zonas blancas sin pigmentar de la flor. [ 187 ]

El proceso de ARN de interferencia (ARNi) se denominó "cosupresión" y "represión" cuando se observó antes del conocimiento de un mecanismo relacionado con el ARN. El descubrimiento del ARNi fue precedido primero por observaciones de inhibición transcripcional por ARN antisentido expresado en plantas transgénicas , [ 188 ] y más directamente por informes de resultados inesperados en experimentos realizados por científicos de plantas en los Estados Unidos y los Países Bajos a principios de la década de 1990. [ 189 ] En un intento por alterar los colores de las flores en las petunias , los investigadores introdujeron copias adicionales de un gen que codifica la chalcona sintasa , una enzima clave para la pigmentación de las flores , en plantas de petunia que normalmente tienen flores rosas o violetas. Se esperaba que el gen sobreexpresado diera como resultado flores más oscuras, pero en cambio causó que algunas flores tuvieran menos pigmento púrpura visible, a veces en patrones variegados, lo que indica que la actividad de la chalcona sintasa había disminuido sustancialmente o se había suprimido de una manera específica del contexto. Otra observación temprana de la interferencia de ARN provino de un estudio del hongo Neurospora crassa , [ 190 ] aunque no se reconoció de inmediato como relacionada. Investigaciones posteriores del fenómeno en plantas indicaron que la regulación negativa se debía a la inhibición postranscripcional de la expresión génica a través de una mayor tasa de degradación del ARNm. [ 191 ] Este fenómeno se denominó cosupresión de la expresión génica , pero el mecanismo molecular permaneció desconocido. [ 192 ]

Poco después, virólogos vegetales que trabajaban en la mejora de la resistencia de las plantas a las enfermedades virales observaron un fenómeno inesperado similar. Si bien se sabía que las plantas que expresaban proteínas específicas del virus mostraban una mayor tolerancia o resistencia a la infección viral, no se esperaba que las plantas que portaban solo regiones cortas no codificantes de secuencias de ARN viral mostraran niveles de protección similares. Los investigadores creían que el ARN viral producido por transgenes también podía inhibir la replicación viral. [ 193 ] El experimento inverso, en el que se introdujeron secuencias cortas de genes vegetales en virus, demostró que el gen objetivo se suprimía en una planta infectada. [ 194 ] Este fenómeno se denominó "silenciamiento génico inducido por virus" (VIGS), [ 174 ] y el conjunto de tales fenómenos se denominó colectivamente silenciamiento génico postranscripcional. [ 195 ]

After these initial observations in plants, laboratories searched for this phenomenon in other organisms.[196][197] The first instance of RNA silencing in animals was documented in 1996, when Guo and Kemphues observed that, by introducing sense and antisense RNA to par-1 mRNA in Caenorhabditis elegans caused degradation of the par-1 message.[198] It was thought that this degradation was triggered by single-stranded RNA (ssRNA), but two years later, in 1998, Fire and Mello discovered that this ability to silence the par-1 gene expression was actually triggered by double-stranded RNA (dsRNA).[198]Craig C. Mello and Andrew Fire's 1998 Nature paper reported a potent gene silencing effect after injecting double stranded RNA into C. elegans.[199] In investigating the regulation of muscle protein production, they observed that neither mRNA nor antisense RNA injections had an effect on protein production, but double-stranded RNA successfully silenced the targeted gene. As a result of this work, they coined the term RNAi. This discovery represented the first identification of the causative agent for the phenomenon. Fire and Mello were awarded the 2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine.[6][200]

RNAi therapeutics

Justo después del revolucionario descubrimiento de Fire y Mello, Elbashir et al. descubrieron que, mediante el uso de siRNA sintético , era posible dirigir el silenciamiento de secuencias específicas en un gen, en lugar de silenciar el gen completo. [ 201 ] Solo un año después, McCaffrey y sus colegas demostraron que este silenciamiento específico de secuencia tenía aplicaciones terapéuticas al dirigirse a una secuencia del virus de la hepatitis C en ratones transgénicos . [ 202 ] Desde entonces, varios investigadores han estado intentando ampliar las aplicaciones terapéuticas del ARN de interferencia (ARNi), buscando específicamente dirigirse a genes que causan varios tipos de cáncer . [ 203 ] [ 204 ] Para 2006, las primeras aplicaciones en llegar a ensayos clínicos fueron en el tratamiento de la degeneración macular y el virus sincitial respiratorio . [ 205 ] Cuatro años después se inició el primer ensayo clínico de fase I en humanos, utilizando un sistema de administración de nanopartículas para dirigirse a tumores sólidos . [ 206 ]

La FDA aprobó el primer fármaco basado en ARNip ( patisiran ) en 2018. Posteriormente, givosiran y lumasiran obtuvieron la aprobación de la FDA para el tratamiento de la hiperparatiroidismo primario (HPP) y la hiperparatiroidismo primario tipo 1 (HP1) en 2019 y 2020, respectivamente. [ 112 ] Inclisiran recibió la aprobación de la EMA en 2020 para el tratamiento del colesterol alto y actualmente está siendo evaluado por la FDA. [ 207 ]

Véase también

Referencias

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  • Tema principal de la web de Terapia Molecular : "El desarrollo del ARN de interferencia como estrategia terapéutica" , una colección de artículos gratuitos sobre el ARN de interferencia como estrategia terapéutica.
  • GenomeRNAi : una base de datos de fenotipos de experimentos de cribado de interferencia de ARN en Drosophila melanogaster y Homo sapiens
  • Herramientas de ARN de interferencia (ARNi) Archivadas el 19 de junio de 2018 en Wayback Machine. Herramientas de interferencia de ARN prediseñadas y personalizadas.

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