Cristalografía racémica

La cristalografía racémica es una técnica utilizada en biología estructural en la que se desarrollan cristales de una molécula de proteína a partir de una mezcla equimolar de una molécula de proteína L de quiralidad natural y su imagen especular de proteína D. ^{[1] [2] Las moléculas de proteína L consisten en L} -aminoácidos "levógiros" y el aminoácido aquiral glicina, mientras que las moléculas de proteína D imagen especular consisten en D-aminoácidos "diestros" y glicina. Normalmente, tanto la proteína L como la proteína D se preparan mediante síntesis química total.

La ligadura química nativa de segmentos peptídicos desprotegidos se utiliza para preparar la cadena polipeptídica de la proteína, que luego se pliega para formar una molécula de proteína. ^[1] En la ligadura química nativa, un tioéster C-terminal de péptido reacciona con un segundo péptido que tiene un residuo de cisteína en su extremo N, para dar un producto con un enlace peptídico en el sitio de ligadura. ^[3] Múltiples segmentos peptídicos desprotegidos se pueden unir de esta manera para dar la cadena polipeptídica de longitud completa, que se pliega para dar la molécula de proteína objetivo. Una vez que se logra la síntesis química de una proteína L, el enantiómero de proteína D se puede fabricar utilizando bloques de construcción de péptidos sintéticos hechos de D-aminoácidos y Gly. ^[1] La síntesis convergente es más efectiva para preparar cadenas polipeptídicas largas, mediante el uso de péptido-hidrazidas, donde la hidrazida se puede convertir en un tioéster para su uso en la ligadura química nativa. La hidrazida es estable a las condiciones de reacción de ligadura química nativa y se puede convertir in situ en un tioéster peptídico reactivo para la siguiente reacción de condensación de ligadura química nativa. ^[4]

Existen tan solo 230 formas diferentes de organizar objetos en matrices tridimensionales regulares. En cristalografía molecular, estas disposiciones se denominan "grupos espaciales". Sin embargo, solo 65 de estas disposiciones son accesibles para objetos quirales o moléculas quirales. Los 165 grupos espaciales restantes contienen un centro de simetría o un plano especular y, por lo tanto, no son accesibles para las proteínas globulares naturales, que son moléculas quirales. Wukowitz y Yeates desarrollaron una teoría matemática para explicar la preferencia de las proteínas globulares por cristalizar en ciertos grupos espaciales. Sugirieron que el grupo espacial preferido estaba determinado por el número de grados de libertad (D) o dimensionalidad como una medida de la facilidad con la que se puede formar una simetría dada. Analizaron el número de grados de libertad para los grupos espaciales quirales y aquirales, donde descubrieron que el grupo espacial P1(bar) con D=8 es teóricamente el grupo espacial más dominante. Dado que el grupo espacial aquiral tenía un mayor grado de libertad en comparación con los grupos espaciales quirales, predijeron que las mezclas racémicas de enantiómeros proteicos cristalizarían más fácilmente en comparación con las proteínas L naturales solas al formar pares aquirales {proteína L más proteína D}. Si bien el grupo espacial P1(bar) es el más preferido, P21/c y C2/c también son altamente preferidos, mientras que se espera que los otros grupos espaciales aquirales aparezcan con menor frecuencia. Por lo tanto, P1(bar), P21/c y C2/c se consideran grupos espaciales centrosimétricos comunes en mezclas racémicas. ^[1]

En 1989, Alan Mackay sugirió que si se pudiera utilizar la síntesis química para producir enantiómeros de proteína L y proteína D, se permitiría el uso de mezclas racémicas para cristalizar proteínas en grupos espaciales centrosimétricos. Afirmó que, debido a que en los datos de difracción de rayos X obtenidos a partir de un cristal centrosimétrico las fases fuera de la diagonal se cancelarían dando lugar a fases que difieren en 180 grados, esto facilitaría la solución del problema de las fases en la determinación de la estructura de las proteínas mediante cristalografía de rayos X. ^[4]

En 1993, Laura Zawadzke y Jeremy Berg utilizaron por primera vez la pequeña proteína (45 aminoácidos) rubredoxina para sintetizarla en forma racémica. Esto se hizo porque la determinación estructural sería potencialmente más fácil y más robusta al utilizar datos de difracción de un cristal centrosimétrico , que requiere crecimiento a partir de una mezcla racémica . Al tener un centro de simetría formado por los pares de proteínas racémicas, los pasos de difracción de fases en el análisis de datos se simplificarían aún más. ^[5] Como se mencionó anteriormente, en 1995 Stephanie Wukovitz y Todd Yeates habían desarrollado una teoría matemática para explicar por qué las moléculas de proteína tienden a cristalizar con mayor frecuencia en ciertos grupos espaciales que en otros; predijeron que el grupo espacial de proteínas más favorecido sería P1<bar>, y predijeron que las proteínas globulares cristalizarían más fácilmente como racematos, a partir de una mezcla de proteínas racémicas. ^[6]

Con el desarrollo de la ligación química nativa en 1994, la síntesis química total de pares de enantiómeros de proteína D y proteína L se hizo factible. En la primera aplicación práctica para resolver una estructura desconocida, se utilizó la cristalografía de rayos X racémica y cuasi-racémica para determinar la estructura de la proteína anticongelante de la pulga de las nieves. En el curso de ese trabajo se observó que las mezclas de proteínas racémicas e incluso cuasi-racémicas facilitaban drásticamente la formación de cristales centrosimétricos de calidad de difracción. Los cuasi-racematos están formados por moléculas de proteína que son imágenes especulares y que no son enantiómeros verdaderos, pero que son objetos de imagen especular suficientemente similares para formar matrices pseudo-centrosimétricas ordenadas. ^[4]

Posteriormente, se ha demostrado que los pares de moléculas de proteína racémica y cuasi racémica preparadas mediante síntesis química total aumentan drásticamente la tasa de éxito en la formación de cristales de calidad de difracción a partir de una amplia gama de moléculas de proteína globulares. ^[7]

Rv1738, una proteína de Mycobacterium tuberculosis , es el producto génico que se regula al alza cuando M. tb entra en un estado de latencia persistente. Las preparaciones de la proteína L Rv1738 expresada de forma recombinante resistieron los intentos extensivos de formar cristales. Una mezcla racémica de las formas de proteína D y proteína L sintetizadas químicamente de Rv1738 dio cristales en el grupo espacial centrosimétrico C2/c. La estructura, que contiene dímeros de proteína L y proteína D en un grupo espacial centrosimétrico, reveló una similitud estructural con los "factores promotores de la hibernación" que pueden unirse a los ribosomas y suprimir la traducción. ^[8]

La cristalización de la proteína ubiquitina se realizó con éxito mediante cristalografía racémica. La cristalización de la D-ubiquitina o la L-ubiquitina solas es difícil, mientras que una mezcla racémica de D-ubiquitina y L-ubiquitina se cristalizó fácilmente y se obtuvieron cristales de calidad de difracción durante la noche en casi la mitad de las condiciones probadas en una pantalla de cristalización comercial estándar. ^[4]

La cristalización de racematos de moléculas de microproteínas que contienen disulfuro se utilizó para determinar la estructura del inhibidor de tripsina SFTI-1 (14 aminoácidos, 1 disulfuro), la conotoxina cVc1.1 (22 aminoácidos, 2 disulfuros) y el ciclótido kB1 (29 aminoácidos, 3 disulfuros). Mediante difracción de rayos X, se encontró que los racematos cristalizaban en los grupos espaciales centrosimétricos P3(bar), Pbca y P1(bar). ^[4]

Curiosamente, se descubrió que las cadenas "peptoides" aquirales se pliegan como pares racémicos y cristalizan en grupos espaciales centrosimétricos altamente preferidos.

Estructura cristalina de alta resolución del racemato de un complejo heteroquiral de proteína D con factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A). La forma de proteína D de imagen especular de VEGF-A se utilizó en la visualización de fagos para identificar un aglutinante de proteína L de 56 residuos con afinidad nanomolar; el aglutinante de proteína D sintetizado químicamente tenía la misma afinidad por la forma de proteína L de VEGF-A. Una mezcla de proteínas sintetizadas químicamente que consistía en D-VEGF-A, L-VEGF-A y dos equivalentes de cada uno del aglutinante de proteína D y del aglutinante de proteína L, dio cristales racémicos en el grupo espacial centrosimétrico P21/n. La estructura de este complejo de proteína heteroquiral de 71 kDa se resolvió a una resolución de 1,6 Å ^[4]