Cuantificación de virus

Los ensayos basados ​​en placas son un método comúnmente utilizado para determinar la concentración de virus en términos de dosis infecciosa . Estos ensayos determinan el número de unidades formadoras de placa (UFP) en una muestra de virus, lo que constituye una medida de la cantidad de virus. El ensayo se basa en un método microbiológico realizado en placas de Petri o placas de cultivo celular de múltiples pocillos . Específicamente, se infecta una monocapa confluente de células huésped aplicando una muestra que contiene el virus en diferentes diluciones y luego se cubre con un medio semisólido , como agar o carboximetilcelulosa , para evitar que la infección viral se propague indiscriminadamente, como ocurriría en un medio líquido. Se forma una placa viral después de que un virus infecta una célula dentro de la monocapa celular fija. ^{[ 2 ]} La célula infectada por el virus se lisa y propaga la infección a las células adyacentes, donde se repite el ciclo de infección-lisis. Esto crea un área de células infectadas y lisadas (placa viral) rodeada de células intactas no infectadas. La placa se puede observar con un microscopio óptico o visualmente mediante técnicas de tinción celular (por ejemplo, tinción con una solución de cristal violeta para visualizar células intactas frente a células lisadas). ^{[ 3 ]} La formación de placas puede tardar de 3 a 14 días, dependiendo del virus que se analice. Generalmente, las placas se cuentan manualmente, y el recuento de placas, en combinación con el factor de dilución de la solución de infección (la muestra aplicada inicialmente a las células), se utiliza para calcular el número de unidades formadoras de placas por unidad de volumen de muestra (UFP/mL). El número de UFP/mL representa la concentración de partículas virales infecciosas dentro de la muestra y se basa en la suposición de que cada placa formada es representativa de una infección inicial por una partícula viral infecciosa. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

El ensayo de formación de focos (FFA, por sus siglas en inglés) es una variante del ensayo de placa, pero en lugar de depender de la lisis celular para detectar la formación de placa, el FFA emplea técnicas de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para un antígeno viral , con el fin de detectar células huésped infectadas y partículas virales infecciosas antes de que se forme una placa. El FFA es particularmente útil para cuantificar clases de virus que no lisan las membranas celulares, ya que estos virus no serían detectables mediante el ensayo de placa. Al igual que en el ensayo de placa, se infectan monocapas de células huésped con diversas diluciones de la muestra viral y se incuban durante un período relativamente breve (p. ej., de 24 a 72 horas) bajo un medio de cultivo semisólido que restringe la propagación del virus infeccioso, creando cúmulos localizados (focos) de células infectadas. Posteriormente, las placas se analizan con anticuerpos marcados con fluorescencia contra un antígeno viral, y se utiliza microscopía de fluorescencia para contar y cuantificar el número de focos. El método FFA generalmente produce resultados en menos tiempo que los ensayos de placa o los ensayos de dosis infecciosa de cultivo tisular al 50% (TCID50 ₎ (véase más abajo), pero puede ser más costoso en términos de reactivos y equipos necesarios. El tiempo de finalización del ensayo también depende del tamaño del área que el usuario está contando. Un área más grande requerirá más tiempo, pero puede proporcionar una representación más precisa de la muestra. Los resultados del FFA se expresan en unidades formadoras de focos por mililitro, o FFU/mL. ^{[ 6 ]}

El ensayo TCID50 ₍ dosis infecciosa en cultivo tisular al 50%) mide el título de virus infeccioso . Este ensayo de dilución de punto final cuantifica la cantidad de virus necesaria para infectar al 50% de los huéspedes infectados o para producir un efecto citopático en el 50% de las muestras de cultivo tisular inoculadas. Este ensayo puede ser más común en aplicaciones de investigación clínica donde se debe determinar la dosis letal del virus o si el virus no forma placas. Cuando se utiliza en el contexto del cultivo tisular, las células huésped se siembran y se añaden diluciones seriadas del virus. Después de la incubación, el porcentaje de muerte celular (es decir, células infectadas) se observa y registra manualmente para cada dilución del virus, y los resultados se utilizan para calcular matemáticamente un resultado de TCID50 _. [ ^{6 ] [ 7 ] Debido} a diferencias significativas en los métodos y principios de ensayo, los resultados de TCID50 _y pfu/mL u otros ensayos de infectividad no son equivalentes. Este método puede tardar hasta una semana debido al tiempo de infectividad celular. ^{[ 8 ]}

Dos métodos comúnmente utilizados para calcular TCID ₅₀ (que también pueden utilizarse para calcular otros tipos de puntos finales del 50%, como EC ₅₀ , IC ₅₀ y LD ₅₀ ) son:

• Spearman–Kärber ^{[ 9 ]}
• Método Reed-Muench

La relación teórica entre TCID ₅₀ y PFU es aproximadamente 0,69 PFU = 1 TCID ₅₀ según la distribución de Poisson , ^{[ 10 ]} una distribución de probabilidad que describe cuántos eventos aleatorios (partículas virales) que ocurren a una tasa promedio conocida (título viral) es probable que ocurran en un espacio fijo (la cantidad de medio viral en un pocillo). Sin embargo, debe enfatizarse que, en la práctica, esta relación puede no cumplirse incluso para la misma combinación de virus + célula, ya que los dos tipos de ensayo se configuran de manera diferente y la infectividad del virus es muy sensible a varios factores como la edad celular, los medios de recubrimiento, etc. Pero la siguiente referencia define la relación de manera diferente:

De ATCC : "Suponiendo que se utilice el mismo sistema celular, que el virus forme placas en esas células y que no se añadan procedimientos que inhiban la formación de placas, se esperaría que 1 ml de stock viral tuviera aproximadamente la mitad del número de unidades formadoras de placas (UFP) que TCID _50. Esto es solo una estimación, pero se basa en el razonamiento de que la dilución limitante que infectaría al 50% de las capas celulares desafiadas a menudo produciría inicialmente una sola placa en las capas celulares que se infectan. En algunos casos, podrían formarse dos o más placas por casualidad, por lo que el número real de UFP debería determinarse experimentalmente."

"Matemáticamente, las UFP esperadas serían algo mayores que la mitad de la TCID50 _, ya que los tubos negativos en la TCID50 _representan cero unidades formadoras de placa y los tubos positivos representan cada uno una o más unidades formadoras de placa. Se obtiene una estimación más precisa aplicando la distribución de Poisson. Donde${\displaystyle P(o)}$⁠ es la proporción de tubos negativos y m es el número medio de unidades infecciosas por volumen (UFP/ml), ⁠${\displaystyle P(o)=\exp(-m)}$⁠ . Para cualquier título expresado como TCID ₅₀ , ⁠${\displaystyle P(o)=0.5}$⁠ . Por lo tanto ⁠${\displaystyle \exp(-m)=0.5}$y​​${\displaystyle m=-\ln 0.5}$que es ~ 0,7.

Por lo tanto, se podría multiplicar el título de TCID ₅₀ (por ml) por 0,7 para predecir el número medio de PFU/ml. Al aplicar estos cálculos, recuerde que la media calculada solo será válida si los cambios en el protocolo necesarios para visualizar las placas no alteran la expresión del virus infeccioso en comparación con la expresión en las condiciones empleadas para TCID ₅₀ .

"Por lo tanto, como estimación práctica, se puede suponer que un material con una TCID ₅₀ de 1 × 10 ⁵ TCID ₅₀ /mL producirá 0,7 × 10 ⁵ PFU/mL." ^{[ 11 ]}

El ensayo de hemaglutinación (HA) es un ensayo común de cuantificación de proteínas no fluorescentes específico para la influenza . Se basa en el hecho de que la hemaglutinina , una proteína de superficie de los virus de la influenza, aglutina los glóbulos rojos (es decir, hace que los glóbulos rojos se agrupen). En este ensayo, se incuban diluciones de una muestra de influenza con una solución de eritrocitos al 1% durante una hora y se determina visualmente la dilución del virus en la que ocurre la primera aglutinación. El ensayo produce un resultado de unidades de hemaglutinación (HAU), con relaciones típicas de PFU a HAU en el rango de 10⁶ ^. [ ^{12 ] [ 13 ] [ 14 ] Este} ensayo tarda aproximadamente 1 a 2 horas en completarse.

El ensayo de inhibición de la hemaglutinación es una variante común del ensayo HA que se utiliza para medir los niveles de anticuerpos específicos contra la gripe en el suero sanguíneo. En esta variante, los anticuerpos séricos contra el virus de la influenza interfieren con la unión del virus a los glóbulos rojos. Por lo tanto, la hemaglutinación se inhibe cuando los anticuerpos están presentes en una concentración suficiente. ^{[ 15 ]}

El ensayo de ácido bicinchonínico (BCA; también conocido como ensayo de Smith) se basa en una medición colorimétrica simple y es un ensayo de cuantificación de proteínas de uso común. ^{[ 16 ]}

El ensayo BCA es similar a los ensayos de proteínas de Lowry o Bradford . El reactivo del ensayo BCA fue desarrollado y fabricado comercialmente por primera vez por Pierce Chemical Company (ahora propiedad de Thermo Fisher Scientific ), que mantuvo la patente hasta 2006. ^{[ 17 ] [ 18 ]}

En el ensayo BCA, los enlaces peptídicos de una proteína reducen cuantitativamente el Cu²⁺ ^a Cu¹⁺ ^, lo que produce un color azul claro. El BCA quelata ^el Cu¹⁺ en una proporción de 2:1, lo que resulta en una especie de color más intenso que absorbe a 562  nm. La absorbancia de una muestra a 562  nm se utiliza para determinar la concentración total de proteína en la muestra. Los resultados del ensayo se comparan con curvas estándar conocidas después del análisis con un espectrofotómetro o lector de placas . ^{[ 19 ]} El tiempo total del ensayo es de 30 minutos a una hora. Si bien este ensayo es ubicuo y rápido, carece de especificidad para las proteínas virales, ya que cuenta todas las proteínas en la muestra. Por lo tanto, la preparación viral que se va a cuantificar debe estar altamente purificada y libre de proteínas del huésped, suero, portador u otras proteínas.

El ensayo inmunoenzimático ( ELISA ) es un ensayo basado en anticuerpos que utiliza un anticuerpo específico para el antígeno , unido químicamente a una enzima (o unido a un segundo anticuerpo unido a una enzima), para detectar la presencia de una cantidad desconocida del antígeno (p. ej., proteína viral) en una muestra. El evento de unión anticuerpo-antígeno se detecta y/o cuantifica mediante la capacidad de la enzima para convertir un reactivo sustrato en una señal detectable que luego se puede usar para calcular la concentración del antígeno objetivo en la muestra. ^{[ 20 ]} La peroxidasa de rábano picante (HRP) es una enzima común utilizada en los esquemas ELISA debido a su capacidad para amplificar la señal y aumentar la sensibilidad del ensayo.

Existen muchas variantes o tipos de ensayos ELISA, pero generalmente se pueden clasificar como indirectos , competitivos , tipo sándwich o inversos . ^{[ 21 ]} Es importante destacar que un ELISA no puede distinguir entre virus infecciosos e inactivos; por lo tanto, puede cuantificar partículas/proteínas virales, pero no la potencia o infectividad viral.

El ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID), también conocido como método de Mancini, es un ensayo de proteínas que detecta la cantidad de antígeno viral específico mediante inmunodifusión en un medio semisólido (p. ej., agar). El medio contiene un antisuero específico para el antígeno de interés y este se coloca en el centro del disco. A medida que el antígeno se difunde en el medio, crea un anillo de precipitado que crece hasta alcanzar el equilibrio. El tiempo del ensayo puede variar de 10 horas a días, dependiendo del tiempo de equilibrio entre el antígeno y el anticuerpo. El diámetro de la zona del anillo se relaciona linealmente con el logaritmo de la concentración de proteína y se compara con los diámetros de zona de estándares de proteínas conocidos para su cuantificación. ^{[ 22 ]} Los ensayos ELISA, que requieren menos material y son más fáciles de realizar e interpretar, han reemplazado en gran medida a los ensayos de inmunodifusión como herramienta de diagnóstico.

La PCR cuantitativa utiliza la química de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el ADN o ARN viral y producir concentraciones suficientemente altas para su detección y cuantificación por fluorescencia. En general, la cuantificación por qPCR se basa en diluciones seriadas de estándares de concentración conocida que se analizan en paralelo con las muestras desconocidas para calibración y referencia. La detección cuantitativa se puede lograr utilizando una amplia variedad de estrategias de detección por fluorescencia, incluidas sondas específicas de secuencia o colorantes fluorescentes no específicos como SYBR Green . ^{[ 23 ]} Las sondas específicas de secuencia, como TaqMan Molecular Beacons o Scorpion, se unen solo al ADN de la secuencia apropiada producida durante la reacción. El colorante SYBR Green se une a todo el ADN de doble cadena ^{[ 24 ]} producido durante la reacción.

Aunque SYBR Green es fácil de usar, su falta de especificidad y menor sensibilidad hacen que la mayoría de los laboratorios utilicen métodos de detección de qPCR basados ​​en sondas. Existen muchas variantes de qPCR, incluido el método de umbral comparativo, que permite la cuantificación relativa mediante la comparación de valores Ct (ciclos de PCR que muestran incrementos estadísticamente significativos en el producto) de múltiples muestras que incluyen un estándar interno . ^{[ 25 ]}

La PCR amplifica todos los ácidos nucleicos objetivo , incluidos los que se originan de partículas virales infecciosas intactas, de partículas virales defectuosas, así como el ácido nucleico libre en solución. Debido a esto, es probable que los resultados de qPCR (expresados ​​en términos de copias del genoma/mL) sean en cantidad mayor que los resultados de TEM. Para la cuantificación viral, la relación de viriones completos a copias de ácido nucleico rara vez es de uno a uno. Esto se debe a que durante la replicación viral, el ácido nucleico y las proteínas virales no siempre se producen en una relación 1:1 y el proceso de ensamblaje viral da como resultado viriones completos, así como cápsides vacías y/o exceso de genomas virales libres. En el ejemplo del virus de la fiebre aftosa , la relación de viriones completos a copias de ARN dentro de una célula huésped en replicación activa es aproximadamente 1:1000. ^{[ 26 ]} Las ventajas de la titulación por qPCR incluyen un tiempo de respuesta rápido (1–4 horas) y sensibilidad (puede detectar concentraciones de virus mucho más bajas que otros métodos).

La detección de pulsos resistivos sintonizables (TRPS) es un método que permite mediciones de partículas individuales de alto rendimiento de partículas virales individuales, a medida que se hacen pasar a través de un nanoporo de tamaño ajustable , una a la vez. ^{[ 27 ]} La técnica tiene la ventaja de determinar simultáneamente el tamaño y la concentración de partículas virales en solución con alta resolución. Esto puede utilizarse para evaluar la estabilidad de la muestra y la contribución de los agregados, así como la concentración total de partículas virales (vp/mL). ^{[ 28 ]}

La medición basada en TRPS se realiza en un tampón iónico y no requiere tinción previa de las muestras antes del análisis, por lo que la técnica es más rápida que aquellas que requieren un pretratamiento con colorantes fluorescentes, con un tiempo total de preparación y medición inferior a 10 minutos por muestra. El análisis de virus basado en TRPS está disponible comercialmente a través de los sistemas qViro-X , que pueden descontaminarse químicamente mediante autoclave después de la medición.

Esta técnica es similar a la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente de partícula única (SP ICP-MS ) descubierta por Degueldre y Favarger (2003) ^{[ 29 ]} y adaptada posteriormente para otras nanopartículas (por ejemplo, coloides de oro, véase Degueldre et al. (2006)). ^{[ 30 ]} La SP ICP-MS se adaptó para el análisis de espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente de virus únicos (SV ICPMS) en un estudio exhaustivo, es decir, Degueldre (2021). ^{[ 31 ]} Este estudio sugiere adaptar este método para la identificación y el recuento de virus únicos (SV). Con registros de ICP-MS de campo sectorial multicanal (MC SF) de alta resolución en modo de detección de SV, el recuento de iones maestros y clave puede permitir el análisis y la identificación de virus únicos. El recuento de 2 a 500 unidades viriales se puede realizar en 20 s. Se propone realizar análisis en antorcha de Ar para los iones maestros : 12C+, 13C+, 14N+, 15N+, y los iones clave 31P+, 32S+, 33S+ y 34S+. Se discuten en detalle todas las interferencias. Se recomienda el uso de MC ICP-MS de alta resolución mientras se exploran opciones con atmósferas anaeróbicas/aeróbicas para mejorar el análisis cuando se utiliza ICP-MS de cuadrupolo. Se investiga la aplicación para dos tipos de virus (SARS-CoV-2 y bacteriófago T5) utilizando análisis de barrido de tiempo y masa fija para los iones virales seleccionados, lo que permite la caracterización de las especies utilizando las relaciones molares N/C, P/C y S/C y la cuantificación de su concentración numérica.

Aunque la mayoría de los citómetros de flujo no tienen la sensibilidad suficiente, existen algunos disponibles comercialmente que pueden utilizarse para la cuantificación de virus. Un contador de virus cuantifica el número de partículas virales intactas en una muestra mediante fluorescencia para detectar proteínas y ácidos nucleicos colocalizados. Las muestras se tiñen con dos colorantes, uno específico para proteínas y otro para ácidos nucleicos, y se analizan a medida que fluyen a través de un haz láser. La cantidad de partículas que producen eventos simultáneos en cada uno de los dos canales de fluorescencia distintos se determina, junto con el caudal de la muestra medido, para calcular una concentración de partículas virales (vp/mL). ^{[ 32 ]} Los resultados son generalmente similares en cantidad absoluta a un resultado de TEM. El ensayo tiene un rango de trabajo lineal de 10 ⁵ –10 ⁹ vp/mL y un tiempo de análisis de ~10 min con un corto tiempo de preparación de la muestra.

Micrografía TEM de tinción negativa del virus de la polio, barra = 50 nm

Sección de viriones H1N1 novedosos incrustados en tejido

La TEM es un tipo especializado de microscopía que utiliza un haz de electrones enfocado con un campo magnético para obtener imágenes de una muestra. La TEM proporciona imágenes con una resolución espacial 1000 veces mayor que la de un microscopio óptico (resolución de hasta 0,2  nm). ^{[ 33 ]} Se requiere una muestra ultrafina teñida negativamente . La preparación de las muestras implica depositar los especímenes sobre una rejilla de TEM recubierta y realizar una tinción negativa con un líquido opaco a los electrones. ^{[ 34 ]} También se pueden examinar muestras incluidas en tejido si se cortan en secciones finas. La preparación de las muestras varía según el protocolo y el usuario, pero generalmente requiere varias horas para completarse. Las imágenes de TEM pueden mostrar partículas virales individuales y el análisis cuantitativo de imágenes se puede utilizar para determinar las concentraciones virales. Estas imágenes de alta resolución también proporcionan información sobre la morfología de las partículas que la mayoría de los otros métodos no pueden. Los resultados cuantitativos de TEM a menudo serán mayores que los de otros ensayos, ya que todas las partículas, independientemente de su infectividad, se cuantifican en el resultado de partículas similares a virus por mL (vlp/mL) informado. La microscopía electrónica de transmisión cuantitativa (TEM) suele funcionar bien para concentraciones de virus superiores a ^10⁶ partículas/mL. Debido al elevado coste de los instrumentos y a la cantidad de espacio e instalaciones de apoyo necesarias, los equipos de TEM solo están disponibles en unos pocos laboratorios.