Amplificación isotérmica mediada por bucles de transcripción inversa

La técnica RT-LAMP se está utilizando como una alternativa más económica y sencilla a la RT-PCR para el diagnóstico precoz de personas infecciosas con COVID-19 . ^{[ 6 ]} Existen diseños de pruebas de acceso abierto (incluidas las proteínas recombinantes ), lo que permite legalmente que cualquier persona pueda producir una prueba. A diferencia de las pruebas rápidas clásicas de flujo lateral , la RT-LAMP permite el diagnóstico precoz de la enfermedad mediante la detección del ARN viral . ^{[ 7 ]}

Las pruebas se pueden realizar sin aislamiento previo de ARN, detectando los virus directamente a partir de hisopos ^{[ 8 ]} o de saliva . ^{[ 9 ]}

Un ejemplo de caso de uso de RT-LAMP fue como experimento para detectar un nuevo virus similar al Tembusu del pato , BYD, llamado así por la región, Baiyangdian , donde fue aislado por primera vez ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 1 ]} Otra aplicación de este método fue en un experimento de 2013 para detectar un virus Akabane usando RT-LAMP. El experimento, realizado en China, aisló el virus de fetos de terneros abortados. ^{[ 12 ]}

La RT-LAMP también se utiliza en serología forense para identificar fluidos corporales. Los investigadores han realizado experimentos para demostrar que este método puede identificar eficazmente ciertos fluidos corporales. Conscientes de sus limitaciones, Su et al. concluyeron que la RT-LAMP solo era capaz de identificar sangre. ^{[ 13 ] [ 14 ]}

Se detecta una secuencia específica del ADNc mediante cuatro cebadores LAMP . Dos de ellos son cebadores internos (FIP y BIP), que sirven de base para que la enzima Bst copie la plantilla en un nuevo ADN. Los cebadores externos (F3 y B3) se unen a la cadena plantilla y facilitan el desarrollo de la reacción.

Al igual que en el caso de la RT-PCR , el procedimiento RT-LAMP comienza con la síntesis de ADN a partir del ARN de la muestra. Esta conversión la realiza una transcriptasa inversa , una enzima derivada de retrovirus capaz de llevar a cabo dicha conversión. ^{[ 15 ]} Este ADN derivado del ARN se denomina ADNc o ADN complementario. La transcriptasa inversa utiliza el cebador FIP para construir una copia de ADN de cadena simple. El cebador F3 también se une a este lado de la cadena molde y desplaza la copia previamente formada.

Esta copia monocatenaria desplazada es una mezcla de ARN diana y cebadores. Los cebadores están diseñados para tener una secuencia que se une a la propia secuencia, formando un bucle.

El cebador BIP se une al otro extremo de esta cadena simple y la ADN polimerasa Bst lo utiliza para construir una cadena complementaria, formando así ADN de doble cadena. El cebador F3 se une a este extremo y desplaza, una vez más, esta molécula de ADN monocatenario recién generada .

Esta nueva cadena simple liberada servirá como punto de partida para la amplificación cíclica LAMP. Este ADN monocatenario tiene una estructura similar a una mancuerna , ya que sus extremos se pliegan y se unen entre sí, formando dos bucles.

La ADN polimerasa y los cebadores FIP o BIP continúan amplificando esta cadena, extendiendo así el producto de la reacción LAMP. Este ciclo puede iniciarse desde el extremo directo o inverso de la cadena utilizando el cebador adecuado. Una vez iniciado, la cadena experimenta una síntesis de ADN autocebada durante la etapa de elongación del proceso de amplificación. Esta amplificación se lleva a cabo en menos de una hora, en condiciones isotérmicas entre 60 y 65  °C.

La lectura de las pruebas RT-LAMP suele ser colorimétrica. Dos de los métodos más comunes se basan en la medición del pH o de los iones de magnesio . La reacción de amplificación provoca una disminución del pH y una caída de los niveles de Mg²⁺. Esto se puede detectar mediante indicadores como el rojo de fenol para el pH y el azul de hidroxinaftol (HNB) para el magnesio. ^{[ 15 ]} Otra opción es utilizar SYBR Green I , un colorante intercalante del ADN. ^{[ 16 ]}