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ribonucleasa pancreática bovina

Un vial de ARNasa A para uso en biología molecular. La ribonucleasa pancreática bovina , también conocida como ribonucleasa pancreática bovina A o simplemente RNasa A , es una e...

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Un vial de ARNasa A para uso en biología molecular.

La ribonucleasa pancreática bovina , también conocida como ribonucleasa pancreática bovina A o simplemente RNasa A , es una enzima ribonucleasa pancreática que escinde el ARN monocatenario . La ribonucleasa pancreática bovina es uno de los sistemas modelo clásicos de la ciencia de las proteínas . [ 1 ] Se han otorgado dos Premios Nobel de Química en reconocimiento al trabajo sobre la ribonucleasa pancreática bovina: en 1972, el Premio fue otorgado a Christian Anfinsen por su trabajo sobre el plegamiento de proteínas y a Stanford Moore y William Stein por su trabajo sobre la relación entre la estructura de la proteína y su mecanismo químico ; [ 2 ] en 1984, el Premio fue otorgado a Robert Bruce Merrifield por el desarrollo de la síntesis química de proteínas. [ 3 ]

Historia

La ribonucleasa pancreática bovina se convirtió en un sistema modelo común en el estudio de las proteínas, principalmente debido a su extrema estabilidad y a la posibilidad de purificarla en grandes cantidades. En la década de 1940, Armour and Company purificó un kilogramo de proteína —una cantidad muy grande, especialmente para los estándares de purificación de proteínas de la época— y ofreció muestras a bajo costo a los científicos interesados. [ 4 ] La posibilidad de obtener un solo lote de enzima purificada la convirtió en un sistema modelo predominante para los estudios de proteínas. Se la sigue denominando comúnmente ribonucleasa A o RNasa A, ya que es el miembro más destacado de su familia de proteínas , conocida también como ribonucleasa pancreática , ribonucleasa A o ribonucleasa I.

Los estudios de Christian Anfinsen sobre el proceso de plegamiento oxidativo de la ribonucleasa pancreática bovina sentaron las bases para comprender la relación entre la secuencia de aminoácidos y la estructura tridimensional plegada de una proteína , y consolidaron la hipótesis termodinámica del plegamiento de proteínas, según la cual la forma plegada de una proteína representa su mínimo de energía libre . [ 4 ] [ 5 ]

La RNasa A fue la primera enzima para la que se propuso un mecanismo catalítico correcto , incluso antes de que se conociera su estructura. [ 6 ] La RNasa A fue la primera proteína en mostrar los efectos de los isómeros no nativos de los enlaces peptídicos que preceden a los residuos de prolina en el plegamiento de proteínas. [ 7 ]

La ribonucleasa pancreática bovina también fue la proteína modelo utilizada para desarrollar numerosos métodos espectroscópicos para el análisis de la estructura proteica, incluyendo espectroscopia de absorbancia , dicroísmo circular , Raman , resonancia paramagnética electrónica (RPE) y resonancia magnética nuclear (RMN). Fue la primera proteína modelo para el desarrollo de métodos químicos para el estudio de proteínas, como la modificación química de cadenas laterales expuestas, el reconocimiento antigénico y la proteólisis limitada de segmentos desordenados. La ribonucleasa S, que es la RNasa A tratada con la proteasa subtilisina , fue la tercera proteína cuya estructura cristalográfica se resolvió, en 1967. [ 8 ]

Estructura y propiedades

Diagrama de cintas etiquetadas de la ribonucleasa A pancreática bovina (código de acceso PDB 7RSA). La cinta de la cadena principal está coloreada de azul (extremo N) a rojo (extremo C). Las cadenas laterales de las cuatro cisteínas unidas por enlaces disulfuro se muestran en amarillo, con sus átomos de azufre resaltados como pequeñas esferas. Los residuos importantes para la catálisis se muestran en magenta.

La RNasa A es una proteína relativamente pequeña (124 residuos, ~13,7 kDa). Se puede caracterizar como una proteína de dos capas.α+β{\displaystyle \alfa +\beta }Proteína con una hendidura profunda para la unión al sustrato de ARN. La primera capa está compuesta por tres hélices alfa (residuos 3-13, 24-34 y 50-60) de la mitad N-terminal de la proteína. La segunda capa consta de tres horquillas β (residuos 61-74, 79-104 y 105-124 de la mitad C-terminal) dispuestas en dos láminas β . Las horquillas 61-74 y 105-124 forman una lámina β antiparalela de cuatro hebras que se encuentra sobre la hélice 3 (residuos 50-60). La horquilla β más larga, 79-104, se une a una hebra β corta (residuos 42-45) para formar una lámina β antiparalela de tres hebras que se encuentra en la hélice 2 (residuos 24-34).

La RNasa A tiene cuatro enlaces disulfuro en su estado nativo: Cys26-Cys84, Cys58-110, Cys40-95 y Cys65-72. Los dos primeros (26-84 y 58-110) son esenciales para el plegamiento conformacional; cada uno une una hélice alfa de la primera capa a una lámina beta de la segunda capa, formando un pequeño núcleo hidrofóbico en su proximidad. Los dos últimos enlaces disulfuro (40-95 y 65-72) son menos esenciales para el plegamiento; cualquiera de ellos puede reducirse (pero no ambos) sin afectar la estructura nativa en condiciones fisiológicas. Estos enlaces disulfuro conectan segmentos de bucle y están relativamente expuestos al disolvente. El enlace disulfuro 65-72 tiene una propensión extraordinariamente alta a formarse, significativamente mayor de lo que cabría esperar de su entropía de bucle , tanto como péptido como en la proteína completa. Esto sugiere que la horquilla β 61-74 tiene una alta propensión a plegarse conformacionalmente.

La RNasa A es una proteína básica (pI = 9,63); sus numerosas cargas positivas son consistentes con su unión al ARN (un polianión ). En términos más generales, la RNasa A es inusualmente polar o, mejor dicho, carece de grupos hidrofóbicos, especialmente alifáticos. Esto podría explicar la necesidad de cuatro enlaces disulfuro para estabilizar su estructura. El bajo contenido hidrofóbico también podría contribuir a reducir la repulsión física entre los grupos altamente cargados (tanto los propios como los del ARN sustrato) y las regiones de baja constante dieléctrica (los residuos no polares).

La hélice α N-terminal de la RNasa A (residuos 3-13) se conecta al resto de la enzima mediante un segmento flexible (residuos 16-23). ​​Como demostró FM Richards, este segmento puede ser escindido por la subtilisina entre los residuos 20 y 21 sin que la hélice N-terminal se disocie del resto de la RNasa A. El complejo péptido-proteína se denomina "RNasa S", el péptido (residuos 1-20) se llama "péptido S" y el resto (residuos 21-124) se llama "proteína S". La constante de disociación del péptido S para la proteína S es de aproximadamente 30 pM; esta fuerte unión puede aprovecharse para la purificación de proteínas mediante la unión del péptido S a la proteína de interés y el paso de la mezcla a través de una columna de afinidad con la proteína S unida. [También funciona un péptido C más pequeño (residuos 1-13).] El sistema modelo de la RNasa S también se ha utilizado para estudiar el plegamiento de proteínas mediante el acoplamiento del plegamiento y la asociación. El péptido S fue el primer péptido de una proteína nativa que mostró tener una estructura secundaria (parpadeante) en aislamiento (por Klee y Brown en 1967).

La RNasa A escinde específicamente después de los nucleótidos de pirimidina . [ 9 ] La escisión se produce en dos pasos: primero, se escinde el enlace 3',5'-fosfodiéster para generar un intermedio 2',3'-fosfodiéster cíclico; segundo, el fosfodiéster cíclico se hidroliza a un 3'-monofosfato. [ 10 ] Puede ser inhibida por la proteína inhibidora de ribonucleasa , por iones de metales pesados ​​y por complejos de uridina-vanadato. [ 10 ]

Mecanismo enzimático

Las cargas positivas de la RNasa A se localizan principalmente en una hendidura profunda entre dos lóbulos. El sustrato de ARN se encuentra en esta hendidura y es escindido por dos residuos de histidina catalíticos , His12 y His119, para formar un intermedio de fosfato cíclico 2',3' que se estabiliza por la cercana Lys41.

Regulación enzimática

Esta proteína puede utilizar el modelo de morfeína de regulación alostérica . [ 11 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Raines RT (1998). "Ribonucleasa A". Chem. Rev. 98 ( 3): 1045– 1066. doi : 10.1021/cr960427h . PMID 11848924 . 
  2. ↑ "El Premio Nobel de Química de 1972" . Nobelprize.org . Consultado el 10 de febrero de 2015 .
  3. ↑ "El Premio Nobel de Química de 1984" . Nobelprize.org . Consultado el 10 de febrero de 2015 .
  4. 1 2 Richards FM (1972). "El premio Nobel de Química de 1972". Science . 178 (4060): 492– 3. Bibcode : 1972Sci...178..492R . doi : 10.1126/science.178.4060.492 . PMID 17754377 . 
  5. ↑ Marshall, GR; Feng, JA; Kuster, DJ (2008). "De vuelta al futuro: Ribonucleasa A" . Biopolymers . 90 (3): 259–77 . doi : 10.1002/bip.20845 . PMID 17868092 . 
  6. ↑ Cuchillo CM, Nogués MV, Raines RT (2011). "Ribonucleasa pancreática bovina: cincuenta años del primer mecanismo de reacción enzimática" . Biochemistry . 50 ( 37): 7835– 7841. doi : 10.1021/bi201075b . PMC 3172371. PMID 21838247 .  
  7. ↑ Schmid, FX; Baldwin, RL (octubre de 1978). "Catálisis ácida de la formación de la especie de plegamiento lento de la RNasa A: evidencia de que la reacción es isomerización de prolina" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 75 (10): 4764–8 . Bibcode : 1978PNAS ...75.4764S . doi : 10.1073/pnas.75.10.4764 . PMC 336200. PMID 283390 .  
  8. ↑ Wyckoff HW, Hardman KD, Allewell NM, Inagami T, Johnson LN, Richards FM (1967). "La estructura de la ribonucleasa-S a una resolución de 3,5 Å" . J. Biol. Chem . 242 (17): 3984–8 . doi : 10.1016/S0021-9258(18)95844-8 . PMID 6037556 . 
  9. ↑ Volkin E, Cohn WE (1953). "Sobre la estructura de los ácidos ribonucleicos. II. Los productos de la acción de la ribonucleasa" . J. Biol. Chem . 205 (2): 767–82 . doi : 10.1016/S0021-9258(18)49221-6 . PMID 13129256 . 
  10. 1 2 Krystal Worthington. "Ribonucleasa - Manual de enzimas de Worthington" . Consultado el 26 de septiembre de 2011 .
  11. ↑ Selwood T, Jaffe EK (2012). " Homo-oligómeros disociativos dinámicos y el control de la función proteica" . Arch. Biochem. Biophys . 519 (2): 131– 43. doi : 10.1016/j.abb.2011.11.020 . PMC 3298769. PMID 22182754 .  

Lecturas adicionales

  • Kartha, G.; Bello, J.; Harker, D. (1967). Estructura terciaria de la ribonucleasa . Boston: Nature. ISBN 0-12-588945-3.
  • Scheraga HA, Wedemeyer WJ, Welker E (2001). "Ribonucleasa A pancreática bovina: estudios de plegamiento oxidativo y conformacional". Ribonucleasas - Parte A. Métodos en enzimología. Vol.  341. págs. 189–221 . doi : 10.1016/S0076-6879(01)41153-0 . ISBN  9780121822422. PMID 11582778 .