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Ribosonda

Una ribosonda, abreviatura de sonda de ARN , es un segmento de ARN marcado que se puede usar para detectar un ARNm o ADN diana durante la hibridación in situ . [ 1 ] Las sondas ...

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Una ribosonda, abreviatura de sonda de ARN , es un segmento de ARN marcado que se puede usar para detectar un ARNm o ADN diana durante la hibridación in situ . [ 1 ] Las sondas de ARN se pueden producir mediante transcripción in vitro de ADN clonado insertado en un plásmido adecuado aguas abajo de un promotor viral. Algunos virus bacterianos codifican sus propias ARN polimerasas , que son altamente específicas para los promotores virales. Usando estas enzimas , NTP marcados e insertos insertados en ambas orientaciones, sentido y antisentido, se pueden generar ribosondas tanto en sentido directo como inverso a partir de un gen clonado .

Desde que James Watson y Francis Crick revelaron la naturaleza de doble hélice de la molécula de ADN (Watson y Crick, 1953 [ 2 ] ), los enlaces de hidrógeno entre las cuatro bases son bien conocidos: la adenina siempre se une a la timina y la citosina siempre se une a la guanina. Este patrón de unión es el principio básico de las tecnologías genéticas modernas. Joseph Gall y Mary Lou Pardue publicaron un artículo en 1969 que demostraba que el ADN ribosómico marcado radiactivamente puede usarse para detectar su secuencia de ADN complementaria en un huevo de rana, [ 3 ] conocidos como los primeros investigadores que usaron sondas de ADN para realizar hibridación in situ. Se demostró que las sondas de ARN podían realizar la misma función y también se usaron con hibridación in situ . Las sondas teñidas con fluorescencia reemplazaron a las sondas radiomarcadas debido a consideraciones de seguridad, estabilidad y facilidad de detección. [ 4 ] Detectar una secuencia de ADN es similar a "buscar una aguja en un pajar, donde la aguja es la secuencia de ADN de interés y el pajar es un conjunto de cromosomas [ 5 ] ". La capacidad de la hélice de ADN para disociarse, volver a unirse y la notable precisión del apareamiento de bases otorgan a las ribosondas la capacidad de localizar su secuencia de ADN complementaria en los cromosomas.

Dos ribosondas independientes han descubierto que las poblaciones celulares más importantes del hipocampo expresan altos niveles de diacilglicerol lipasa α (DGL-α), una enzima implicada en la producción del endocannabinoide 2-araquidonilglicerol (2-AG: C 23 H 38 O 4 ; 20: 4 , ω-6 ). [ 6 ]

Aplicaciones

Hay dos tipos de sondas utilizadas durante la hibridación in situ: ribosondas y sondas de oligonucleótidos de ADN. [ 7 ] Las ribosondas son esenciales en el estudio del desarrollo embrionario en el que las sondas de ADN son insuficientes. Con sondas de ARN antisentido marcadas (teñidas con fluorescencia, por ejemplo) hibridadas con el ARNm del embrión en desarrollo, es posible rastrear la expresión de genes en diferentes etapas del desarrollo. Las sondas de ARN se pueden utilizar para detectar el desarrollo de todo el embrión o solo en secciones de tejido de interés. La capacidad de las ribosondas para unirse al ARNm transcrito hace que las sondas de ARN sean importantes en la investigación en organismos modelo : Drosophila, pez cebra, pollo, Xenopus y ratón. [ 8 ] Las sondas de ARN también se pueden utilizar en inmunohistoquímica para identificar infecciones de tejido en embriones. [ 9 ] El ARNm viral puede ser el objetivo de sus sondas de ARN antisentido, mientras que los tejidos infectados no tienen ARNm complementario que pueda hibridar con las sondas; La secuencia única de ARNm de cada organismo hace que la detección de la expresión de ciertos genes sea altamente eficaz y precisa.

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es la técnica de ribosonda más utilizada. En FISH, son esenciales una secuencia diana y una sonda. Primero, la sonda se marca mediante una estrategia de marcaje directo o indirecto: en el marcaje indirecto se utilizan nucleótidos modificados con hapteno, y en el marcaje directo, nucleótidos modificados con fluoróforo. El ADN diana y las sondas se desnaturalizan y se mezclan, lo que permite la reasociación de las secuencias de ADN. El marcaje indirecto requiere un paso adicional para producir señales visualizables, que requiere el uso de un sistema enzimático o inmunológico, pero proporciona una mayor amplificación de la señal que el marcaje directo. [ 10 ]

Las sondas FISH también se pueden utilizar en estudios de cariotipo . Las sondas de ADN se pueden marcar con diversos fluorocromos que producen un color único para cada cromosoma. Posteriormente, las sondas se hibridan con cromosomas en metafase, generando patrones únicos en cada cromosoma. Este método resulta útil para estudiar la translocación, deleción y duplicación de cromosomas a mayor escala que con la técnica FISH específica de sitio. [ 11 ]

Referencias

  1. ↑ Lackie, John (2010). Diccionario de biomedicina . Oxford University Press. ISBN 9780199549351.
  2. ↑ Watson, JD; FHC, Crick (1953). "Estructura molecular de los ácidos nucleicos: Una estructura para el ácido desoxirribonucleico". Nature . 171 (4356): 737– 738. doi : 10.1038/171737a0 . PMID 13054692. S2CID 4253007 .  
  3. ↑ Gall, JG; Pardue, ML (1969). "Formación y detección de moléculas híbridas de ARN-ADN en preparaciones citológicas" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 63 (2): 378– 383. doi : 10.1073/pnas.63.2.378 . PMC 223575. PMID 4895535 .  
  4. ↑ Rudkin, GT; Stollar, BD (1977). "Alta resolución de híbridos ADN-ARN in situ mediante inmunofluorescencia indirecta". Nature . 265 (5593): 472– 474. doi : 10.1038/265472a0 . PMID 401954. S2CID 4165112 .  
  5. ↑ O'Connor, Clare (2008). "Hibridación fluorescente in situ (FISH)". Nature Education . 1 : 171.
  6. ↑ Katona, István; Urbano, Gabriella M.; Wallace, Mateo; Ledent, Catalina; Jung, Kwang-Mook; Piomelli, Daniele; Mackie, Ken; Freund, Tamás F. (24 de mayo de 2006). "Composición molecular del sistema endocannabinoide en las sinapsis glutamatérgicas" . Revista de Neurociencia . 26 (21): 5628– 5637. doi : 10.1523/JNEUROSCI.0309-06.2006 . ISSN 0270-6474 . PMC 1698282 . PMID 16723519 .   
  7. ↑ Lajtha, Abel (2007). Manual de neuroquímica y neurobiología molecular: Método práctico de neuroquímica . Estados Unidos: Springer Science & Business Media. pág. 364. ISBN  9780387303598.
  8. ↑ Clark, Melody (1996). Hibridación in situ . ISBN 9783527308859.
  9. ↑ DR, Kapczy (2001). "Detección del virus de la bronquitis infecciosa inoculado in ovo mediante inmunohistoquímica e hibridación in situ con una ribosonda en células epiteliales del pulmón y la cloaca". Enfermedades aviares . 46 (3 (jul.–sep., 2002)): 679– 685. doi : 10.1637/0005-2086(2002)046 [ 0679:doioii ] 2.0.co ; 2 . S2CID 12144776 . 
  10. ↑ Speicher, MR; et al. (2005). "La nueva citogenética: difuminando los límites con la biología molecular". Nature Reviews Genetics . 6 (10): 782– 92. doi : 10.1038/nrg1692 . PMID 16145555 . S2CID 15023775 .   
  11. ↑ McNeil, N.; Ried, T. (2000). "Nuevas técnicas citogenéticas moleculares para identificar reordenamientos cromosómicos complejos: tecnología y aplicaciones en medicina molecular". Expert Reviews in Molecular Medicine . 2000 : 1–14 . doi : 10.1017/S1462399400001940 . PMID 14585138. S2CID 196593251 .  

Baynes, John W.; Marek H. Dominiczak (2005). Bioquímica médica , 2.ª edición . Elsevier Mosby . pág. 477. ISBN  978-0-7234-3341-5.

Vídeo de YouTube: hibridación in situ

  • https://www.youtube.com/watch?v=1iRynlXIJw0

Descripción detallada de la hibridación in situ por fluorescencia:

  • http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327#

Manual técnico de los sistemas de transcripción in vitro Riboprobe:

  • https://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/0/riboprobe-in-vitro-transcription-systems-protocol/