Transcripción de ejecución

La transcripción continua es una técnica in vitro que se utiliza para sintetizar moléculas de ARN a partir de una plantilla de ADN mediante ARN polimerasa purificada . El método se denomina "transcripción continua" porque la transcripción prosigue hasta que la polimerasa alcanza el final del fragmento de ADN, produciendo un ARN de longitud definida y predecible. Este ensayo se utiliza para estudiar la actividad de los promotores , para comprobar cómo influyen los cambios específicos en la secuencia de ADN en el inicio de la transcripción y para generar productos de ARN de tamaño preciso para ensayos posteriores. Dado que la reacción se produce fuera de la célula, la transcripción continua ofrece un control estricto sobre la plantilla y las condiciones de reacción, pero no reproduce completamente la complejidad de la regulación génica in vivo .

Más específicamente, la transcripción de terminación se utiliza para determinar el sitio exacto de inicio de la transcripción (ubicado 1 par de bases corriente abajo del promotor) y para evaluar la precisión y la tasa de transcripción in vitro . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} También se puede utilizar para medir cuantitativamente cómo las alteraciones en las secuencias promotoras afectan la producción transcripcional. ^{[ 4 ]} Sin embargo, debido a su naturaleza in vitro , el ensayo no puede predecir con precisión los niveles de transcripción específicos del tipo celular, a diferencia de los métodos in vivo como los ensayos de transcripción nuclear de terminación . ^{[ 1 ] [ 2 ]}

Michael Chamberlin , quien falleció mientras dormía en noviembre de 2025, fue la primera persona en aislar la ARN polimerasa de Escherichia coli como estudiante de posgrado en la Universidad de Stanford junto con el fallecido Paul Berg y revolucionó la comprensión del proceso de transcripción. ^{[ 5 ]}

Para realizar un ensayo de transcripción de terminación, se clona un gen de interés, incluido el promotor , en un plásmido . ^{[ 4 ]} El plásmido se digiere en un sitio de corte de enzima de restricción conocido corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción de manera que el producto de terminación de ARNm esperado se separe fácilmente por electroforesis en gel . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 4 ]} El ADN debe estar altamente purificado antes de realizar este ensayo. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Para iniciar la transcripción, se agregan UTP radiomarcado , los otros nucleótidos y ARN polimerasa al ADN linealizado. ^{[ 1 ] [ 2 ]} La transcripción continúa hasta que la ARN polimerasa llega al final del ADN donde simplemente “termina” la plantilla de ADN, lo que resulta en un fragmento de ARNm de una longitud definida. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Este fragmento puede luego separarse por electroforesis en gel, junto con estándares de tamaño, y autorradiografía. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 4 ]} El tamaño correspondiente de la banda representará el tamaño del ARNm desde el sitio de corte de la enzima de restricción hasta el sitio de inicio de la transcripción (+1). ^{[ 4 ]} La intensidad de la banda indicará la cantidad de ARNm producido. ^{[ 4 ]} Además, se puede utilizar para detectar si la transcripción se lleva a cabo o no bajo ciertas condiciones (es decir, en presencia de diferentes sustancias químicas). ^{[ 6 ]}

Preparación de la plantilla de ADN: Las plantillas de ADN para el ensayo de transcripción son plásmidos o fragmentos de ADN bicatenario (dsDNA) construidos con oligonucleótidos sintetizados. La plantilla de ADN circular que contiene la secuencia promotora (promotor T7) se linealiza mediante una endonucleasa de restricción que corta aguas abajo de la región que se va a transcribir. Esto garantiza que la ARN polimerasa transcribirá el ADN hasta que finalice la secuencia linealizada.

Ensamblaje del ensayo de transcripción: La molécula de ADN linealizada se mezcla con Tris-HCl, MgCl₂ _, espermidina , DTT y nucleótidos (ATP, GTP, CTP, UTP). La reacción se incuba a 37 °C durante 7 °C. También se pueden añadir nucleótidos radiomarcados o marcados con fluorescencia. Para ensayos a gran escala, se recomienda la adición de un inhibidor de ribonucleasa y pirofosfatasas inorgánicas para mejorar la calidad y el rendimiento de los transcritos. ^{[ 7 ]} Después de la transcripción, el exceso de plantilla de ADN se puede eliminar mediante tratamiento con DNasa.

• Evolución dirigida: La transcripción in vitro es un método fundamental en los experimentos de evolución dirigida que requieren la generación de bibliotecas de ARN grandes y diversas, como ribozimas y aptámeros. En estos sistemas, conjuntos de secuencias de ADN aleatorias o mutagenizadas se linealizan y transcriben in vitro utilizando la ARN polimerasa T7 para producir moléculas de ARN uniformes cuyos límites 5' y 3' están definidos con precisión por la plantilla. Esta síntesis controlada por plantilla es esencial para mantener una relación genotipo-fenotipo consistente durante la selección, ya que cada variante debe expresarse como un ARN de longitud completa para plegarse y funcionar correctamente. Los experimentos SELEX (Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial) originales de Tuerk y Gold utilizaron la transcripción in vitro de bibliotecas de ADN aleatorias para generar conjuntos de ARN para selecciones de unión iterativas contra la ADN polimerasa T4, estableciendo el método como base para la evolución de aptámeros . ^{[ 8 ]} De manera similar, Bartel y Szostak aplicaron la transcripción de depuración para producir bibliotecas que superaban las 10¹⁵ moléculas de ARN únicas en su aislamiento de nuevos ARN catalíticos, demostrando cómo la transcripción in vitro eficiente permite la selección de ribozimas de alta complejidad. ^{[ 9 ]} Las selecciones posteriores de Lehman y Joyce también se basaron en la transcripción de depuración para regenerar grandes poblaciones de ARN después de cada ronda de enriquecimiento basado en catálisis. ^{[ 10 ]} Debido a que cada ciclo de mutación, selección y amplificación requiere la regeneración de moléculas de ARN definidas con precisión, la transcripción de depuración sigue siendo uno de los pasos preparatorios fundamentales en la evolución dirigida basada en ARN.
• Análisis de microarrays de transcripción in vitro (ROMA): La expresión génica bacteriana puede regularse en muchos niveles, incluyendo la activación o represión de factores de transcripción que se unen al ADN en el sitio de inicio de la transcripción o la ARN polimerasa que contiene diferentes factores sigma . Se utiliza la holoenzima de la ARN polimerasa purificada en ADN genómico fragmentado para la transcripción in vitro y los transcritos de ARNm se identifican mediante análisis de hibridación de microarrays. Posteriormente, ROMA permitió investigar los efectos directos de diferentes factores sigma, como los factores sigma 70 y 38 superpuestos, sin proteína reguladora. ^{[ 11 ]}  ROMA está limitado por la falta de resolución de un solo nucleótido y la lectura transcripcional completa en genes originados convergentemente, lo que puede generar señales falsas positivas. ^{[ 12 ]}
• Transcripción de ejecución/RNA-Seq (ROSE): Para superar las limitaciones de ROMA, los científicos desarrollaron ROSE, un enfoque ascendente destinado a ensamblar la maquinaria transcripcional para complementar el perfilado transcriptómico in vivo descendente en el ADN genómico de E. coli K-12 MG1655. Se trata de una transcripción in vitro a escala genómica con ARN polimerasa, ribonucleótidos y ADN genómico aislados. Se prepara una biblioteca de transcripciones nativas específicas del extremo 5' para proporcionar lecturas distintivas del punto de inicio de la transcripción. Esto permite la detección de secuencias promotoras con resolución de un solo nucleótido. ^{[ 13 ]}

• Procesividad limitada : Las ARN polimerasas de bacteriófagos como T7, SP6 y T3 pueden disociarse del molde de ADN antes de alcanzar el final del fragmento lineal, produciendo transcritos truncados. Esta terminación prematura ocurre con mayor frecuencia en moldes largos o que contienen estructuras secundarias fuertes que impiden la elongación. Milligan et al. demostraron que la ARN polimerasa T7 muestra una disminución medible en la procesividad en moldes que superan varios cientos de nucleótidos, lo que da lugar a productos de transcripción más cortos de lo esperado en condiciones estándar in vitro. ^{[ 14 ] [ 15 ]}
• Alta sensibilidad a la sal: La transcripción de terminación es altamente sensible a la fuerza iónica, ya que las sales monovalentes (NaCl, KCl) inhiben la estabilidad del complejo ARN polimerasa-promotor y reducen la eficiencia de la elongación. Las condiciones de alta concentración salina desestabilizan el complejo abierto y ralentizan la transición de la iniciación a la elongación productiva. Milligan et al. informaron que el aumento de las concentraciones de sal reduce significativamente la eficiencia de transcripción de la ARN polimerasa T7, lo que indica una fuerte dependencia iónica de las interacciones promotor-polimerasa. ^{[ 14 ] [ 15 ]}
• Productos no deseados resultantes de la síntesis abortiva: Durante las primeras etapas de la transcripción, las ARN polimerasas frecuentemente producen transcripciones abortivas cortas (de 2 a 10 nucleótidos) antes de pasar a la elongación procesiva. Estos ARN cortos se acumulan en las reacciones de transcripción incompleta y pueden complicar la cuantificación de los productos de longitud completa. McAllister y sus colegas demostraron que el ciclo abortivo es una característica inherente de la iniciación de la ARN polimerasa T7, particularmente cuando el espaciamiento del promotor o las concentraciones de NTP de iniciación son subóptimas. ^{[ 16 ] [ 17 ]}
• Adición de un nucleótido no apareado en el extremo 3' del transcrito de terminación: Las ARN polimerasas T7 y SP6 pueden añadir uno o más nucleótidos no codificados al extremo 3' del ARN naciente, incluso cuando la plantilla de ADN termina limpiamente en un sitio de restricción . Esta heterogeneidad en el extremo 3' surge de la actividad de la transferasa terminal independiente de la plantilla de la polimerasa. Pleiss et al. demostraron adiciones consistentes de nucleótidos en el extremo 3' en los transcritos de terminación de T7, mientras que Helm y Brulé informaron de manera similar la incorporación de nucleótidos no codificados durante las reacciones de transcripción in vitro de SP6 y T7. ^{[ 15 ] [ 18 ] [ 19 ]}

Para superar las limitaciones del uso de la ARN polimerasa T7 , el bacteriófago T3 y la ARN polimerasa SP6, los científicos realizaron grandes esfuerzos para mejorar la homogeneidad del extremo 3' de los transcritos de T7, incluyendo modificaciones de la plantilla de ADN y la unión de ribozimas al extremo 3' de los ARN deseados. Para este propósito, se caracterizó un organismo marino llamado cianófago Syn5, una ARN polimerasa de una sola subunidad. La ARN polimerasa Syn5 puede reconocer una secuencia promotora relativamente corta, presenta una alta tolerancia a la sal, una alta procesividad debido a dos secuencias promotoras en su genoma y, lo que es más importante, tiene una homogeneidad mucho mayor en los extremos 3' de sus productos de ARN. Puede producir transcritos de terminación precisos que carecen de nucleótidos adicionales no básicos, lo cual es crucial para la síntesis in vitro de ARNt, sondas de ARN y cebadores de ARN. La ARN polimerasa Syn5 exhibe mayor estabilidad que la ARN polimerasa T7 durante 4 horas de incubación a 37 °C. ^{[ 20 ]}