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microscopía de imágenes de segundo armónico

La microscopía de imagen de segundo armónico ( SHIM ) se basa en un efecto óptico no lineal conocido como generación de segundo armónico (SHG). La SHIM se ha consolidado como un...

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La microscopía de imagen de segundo armónico ( SHIM ) se basa en un efecto óptico no lineal conocido como generación de segundo armónico (SHG). La SHIM se ha consolidado como un mecanismo de contraste viable para la obtención de imágenes microscópicas , permitiendo la visualización de la estructura y función de células y tejidos . [ 1 ] Un microscopio de segundo armónico obtiene contrastes a partir de variaciones en la capacidad de una muestra para generar luz de segundo armónico a partir de la luz incidente, mientras que un microscopio óptico convencional obtiene su contraste detectando variaciones en la densidad óptica , la longitud del recorrido óptico o el índice de refracción de la muestra. La SHG requiere luz láser intensa que atraviese un material con una estructura molecular no centrosimétrica , ya sea inherente o inducida externamente, por ejemplo, mediante un campo eléctrico. [ 2 ]

La luz de segundo armónico que emerge de un material SHG tiene exactamente la mitad de la longitud de onda (frecuencia duplicada) de la luz que incide sobre el material. Si bien la fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF) también es un proceso de dos fotones, la TPEF pierde algo de energía durante la relajación del estado excitado, mientras que la SHG conserva la energía. Normalmente, se utiliza un cristal inorgánico para producir luz SHG, como el niobato de litio (LiNbO₃ ) , el fosfato de titanilo de potasio (KTP = KTiOPO₄ ) o el triborato de litio (LBO = LiB₃O₅ ) . Aunque la SHG requiere que un material tenga una orientación molecular específica para que la luz incidente se duplique en frecuencia, algunos materiales biológicos pueden ser altamente polarizables y ensamblarse en estructuras no centrosimétricas grandes y bastante ordenadas. Si bien algunos materiales biológicos como el colágeno, los microtúbulos y la miosina muscular [ 3 ] pueden producir señales SHG, incluso el agua puede ordenarse y producir una señal de segundo armónico bajo ciertas condiciones, lo que permite a la microscopía SH obtener imágenes de potenciales superficiales sin moléculas de marcaje. [ 2 ] El patrón SHG está determinado principalmente por la condición de coincidencia de fase. Una configuración común para un sistema de imágenes SHG tendrá un microscopio de escaneo láser con un láser de titanio-zafiro de modo bloqueado como fuente de excitación. La señal SHG se propaga en la dirección de avance. Sin embargo, algunos experimentos han demostrado que los objetos del orden de aproximadamente una décima parte de la longitud de onda de la señal SHG producida producirán señales de avance y retroceso casi iguales.

Imagen de segundo armónico del colágeno (mostrado en blanco) en el hígado.

Ventajas

SHIM ofrece varias ventajas para la obtención de imágenes de células y tejidos vivos. A diferencia de otras técnicas como la microscopía de fluorescencia , la generación de segundo armónico ( SHG) no implica la excitación de moléculas; por lo tanto, las moléculas no deberían sufrir los efectos de la fototoxicidad o el fotoblanqueo . Además, dado que muchas estructuras biológicas producen señales SHG intensas, no se requiere el marcaje de moléculas con sondas exógenas , lo que también puede alterar el funcionamiento de un sistema biológico. Al utilizar longitudes de onda del infrarrojo cercano para la luz incidente, SHIM permite construir imágenes tridimensionales de muestras, penetrando en tejidos más gruesos.

Diferencias y complementariedad con la fluorescencia de dos fotones (2PEF)

La fluorescencia de dos fotones ( 2PEF ) es un proceso muy diferente de la generación de segundo armónico ( SHG ): implica la excitación de electrones a niveles de energía superiores y la posterior desexcitación mediante la emisión de fotones (a diferencia de la SHG, aunque también es un proceso de dos fotones). Por lo tanto, la 2PEF es un proceso no coherente , tanto espacialmente (emisión isotrópica) como temporalmente (espectro amplio y dependiente de la muestra). Además, a diferencia de la SHG, no es específica de una estructura determinada. [ 4 ]

Por lo tanto, se puede acoplar a SHG en imágenes multifotónicas para revelar algunas moléculas que sí producen autofluorescencia , como la elastina en los tejidos (mientras que SHG revela colágeno o miosina , por ejemplo). [ 4 ]

Historia

Antes de que se utilizara SHG para imágenes, la primera demostración de SHG fue realizada en 1961 por PA Franken, G. Weinreich , CW Peters y AE Hill en la Universidad de Michigan, Ann Arbor, utilizando una muestra de cuarzo. [ 5 ] En 1968, Bloembergen descubrió SHG de interfaces [ 6 ] y desde entonces se ha utilizado como una herramienta para caracterizar superficies y sondear la dinámica de las interfaces. En 1971, Fine y Hansen informaron la primera observación de SHG de muestras de tejido biológico. [ 7 ] En 1974, Robert W. Hellwarth y Christensen informaron por primera vez la integración de SHG y microscopía al obtener imágenes de señales SHG de ZnSe policristalino . [ 8 ] En 1977, Colin Sheppard obtuvo imágenes de varios cristales SHG con un microscopio óptico de barrido. Los primeros experimentos de imágenes biológicas fueron realizados por Freund y Deutsch en 1986 para estudiar la orientación de las fibras de colágeno en el tendón de la cola de rata . [ 9 ] En 1993, Lewis examinó la respuesta del segundo armónico de los colorantes estirílicos en campos eléctricos . También mostró trabajos sobre imágenes de células vivas. En 2006, el grupo de Goro Mizutani desarrolló un microscopio SHG sin escaneo que acorta significativamente el tiempo requerido para la observación de muestras grandes, incluso si el microscopio de campo amplio de dos fotones se publicó en 1996 [ 10 ] y podría haberse utilizado para detectar SHG. El microscopio SHG sin escaneo se utilizó para la observación de almidón vegetal , [ 11 ] [ 12 ] megamolécula, [ 13 ] seda de araña [ 14 ] [ 15 ] y así sucesivamente. En 2010, SHG se extendió a imágenes in vivo de animales completos . [ 16 ] [ 17 ] En 2019, las aplicaciones de SHG se ampliaron cuando se aplicó al uso de imágenes selectivas de agroquímicos directamente en superficies de hojas para proporcionar una forma de evaluar la efectividad de los pesticidas. [ 18 ]

Mediciones cuantitativas

Anisotropía orientacional

La anisotropía de polarización de SHG se puede utilizar para determinar la orientación y el grado de organización de las proteínas en los tejidos, ya que las señales SHG tienen polarizaciones bien definidas. Al utilizar la ecuación de anisotropía: [ 19 ]

Ipagar−IpagmirpagIpagar+2Ipagmirpag=r{\displaystyle {\frac {I_{par}-I_{perp}}{I_{par}+2I_{perp}}}=r}

y adquiriendo las intensidades de las polarizaciones en las direcciones paralela y perpendicular. Una altar{\displaystyle r}El valor indica una orientación anisotrópica, mientras que un valor bajo.r{\displaystyle r}El valor indica una estructura isotrópica. En el trabajo realizado por Campagnola y Loew, [ 19 ] se encontró que las fibras de colágeno formaban estructuras bien alineadas con unar=0,7{\displaystyle r=0.7}valor.

SHG hacia adelante sobre SHG hacia atrás

La generación de segundo armónico ( SHG ) es un proceso coherente ( espacial y temporalmente ), por lo que conserva información sobre la dirección de la excitación y no se emite isotrópicamente. Se emite principalmente en la dirección de avance (igual que la excitación), pero también puede emitirse en la dirección de retroceso dependiendo de la condición de coincidencia de fase . De hecho, la longitud de coherencia más allá de la cual disminuye la conversión de la señal es:

ldo=2/Δk{\displaystyle l_{c}=2/\Delta k}

conΔk∝1/(norte2ω−norteω){\displaystyle \Delta k\propto 1/(n_{2\omega}-n_{\omega})}para adelante, peroΔkbwd∝1/(norte2ω+norteω){\displaystyle \Delta k_{bwd}\propto 1/(n_{2\omega }+n_{\omega })}para hacia atrás tal queldo{\displaystyle l_{c}}>>ldo,bwd{\displaystyle l_{c,bwd}}Por lo tanto, las estructuras más gruesas aparecerán preferentemente en la dirección de avance y las más delgadas en la de retroceso: dado que la conversión SHG depende en primera aproximación del cuadrado del número de convertidores no lineales, la señal será mayor si es emitida por estructuras gruesas, por lo que la señal en la dirección de avance será mayor que en la de retroceso. Sin embargo, el tejido puede dispersar la luz generada y una parte de la SHG en la dirección de avance puede ser retroreflejada en la dirección de retroceso. [ 20 ] Entonces, se puede calcular la relación adelante/atrás F/B, [ 20 ] y es una métrica del tamaño global y la disposición de los convertidores SHG (generalmente fibrillas de colágeno). También se puede demostrar que cuanto mayor sea el ángulo fuera del plano del dispersor, mayor será su relación F/B (véase la figura 2.14 de [ 21 ] ).

SHG con resolución de polarización

Las ventajas de la polarimetría se acoplaron a la SHG en 2002 por Stoller et al. [ 22 ] La polarimetría puede medir la orientación y el orden a nivel molecular, y acoplada a la SHG puede hacerlo con la especificidad de ciertas estructuras como el colágeno: la microscopía SHG resuelta en polarización (p-SHG) es, por lo tanto, una extensión de la microscopía SHG. [ 23 ] La p-SHG define otro parámetro de anisotropía, como: [ 24 ]

ρ=IpagarIpagmirpag{\displaystyle \rho ={\sqrt {\frac {I_{par}}{I_{perp}}}}}

que es, al igual que r , una medida de la orientación principal y el desorden de la estructura que se está visualizando. Dado que a menudo se realiza en filamentos cilíndricos largos (como el colágeno), esta anisotropía suele ser igual aρ=χincógnitaincógnitaincógnita(2)χincógnitaYY(2){\displaystyle \rho ={\frac {\chi _{XXX}^{(2)}}{\chi _{XYY}^{(2)}}}} , [ 25 ] dondeχ(2){\displaystyle \chi ^{(2)}}es el tensor de susceptibilidad no lineal y X la dirección del filamento (o dirección principal de la estructura), Y ortogonal a X y Z la propagación de la luz de excitación. La orientación ϕ de los filamentos en el plano XY de la imagen también se puede extraer de p-SHG mediante análisis FFT y colocar en un mapa. [ 25 ] [ 26 ]

Cuantificación de la fibrosis

El colágeno (un caso particular, pero ampliamente estudiado en microscopía SHG) puede existir en diversas formas  : 28 tipos diferentes, de los cuales 5 son fibrilares. Uno de los retos consiste en determinar y cuantificar la cantidad de colágeno fibrilar en un tejido para poder observar su evolución y su relación con otros materiales no colagenosos. [ 27 ]

Para ello, es necesario corregir una imagen de microscopía SHG para eliminar la pequeña cantidad de fluorescencia residual o ruido presente en la longitud de onda SHG. Posteriormente, se puede aplicar una máscara para cuantificar el colágeno dentro de la imagen. [ 27 ] Entre otras técnicas de cuantificación, probablemente sea la que presenta mayor especificidad, reproducibilidad y aplicabilidad, a pesar de su complejidad. [ 27 ]

Otros

También se ha utilizado para demostrar que los potenciales de acción retropropagantes invaden las espinas dendríticas sin atenuación de voltaje, estableciendo una base sólida para futuros trabajos sobre la potenciación a largo plazo . Su uso aquí fue que proporcionó una forma de medir con precisión el voltaje en las diminutas espinas dendríticas con una precisión inalcanzable con la microscopía estándar de dos fotones. [ 28 ] Mientras tanto, la SHG puede convertir eficientemente la luz infrarroja cercana en luz visible para permitir la terapia fotodinámica guiada por imágenes, superando las limitaciones de profundidad de penetración. [ 29 ]

Materiales que pueden ser visualizados

Imágenes de tejidos biológicos obtenidas mediante microscopía de generación de segundo armónico (SHG). (a) Corte transversal de una córnea humana. (b) Músculo esquelético de pez cebra (miosina). (c) Tendón de la cola de un ratón adulto. (d) Cartílago superficial de la rodilla de un caballo adulto.

La microscopía SHG y sus extensiones pueden utilizarse para estudiar diversos tejidos: en la figura siguiente se muestran algunas imágenes de ejemplo. El colágeno dentro de la matriz extracelular sigue siendo su principal aplicación. Se puede encontrar en tendones, piel, hueso, córnea, aorta, fascia, cartílago, menisco, discos intervertebrales, etc.

La miosina también puede visualizarse en el músculo esquelético o en el músculo cardíaco.

Acoplamiento con microscopía THG

La microscopía de generación de tercer armónico (THG) puede ser complementaria a la microscopía de generación de segundo armónico (SHG), ya que es sensible a las interfaces transversales y a la susceptibilidad no lineal de tercer orden.χ(3){\displaystyle \chi ^{(3)}}[ 35 ] [ 36 ]

Aplicaciones

Progresión del cáncer, caracterización del tumor

La densidad mamográfica se correlaciona con la densidad de colágeno , por lo que la SHG puede utilizarse para identificar el cáncer de mama . [ 37 ] La ​​SHG se suele acoplar a otras técnicas no lineales, como la dispersión Raman anti-Stokes coherente o la microscopía de excitación de dos fotones , como parte de una rutina denominada microscopía (o tomografía) multifotónica, que proporciona una histología in vivo no invasiva y rápida de biopsias que podrían ser cancerosas. [ 38 ]

Cáncer de mama

La comparación de imágenes SHG de avance y retroceso proporciona información sobre la microestructura del colágeno, que a su vez está relacionada con el grado y estadio de un tumor , y su progresión en la mama . [ 39 ] La comparación de SHG y 2PEF también puede mostrar el cambio de orientación del colágeno en los tumores . [ 40 ] Si bien la microscopía SHG ha contribuido mucho a la investigación del cáncer de mama, aún no se ha establecido como una técnica fiable en hospitales , ni para el diagnóstico de esta patología en general. [ 39 ]

cáncer de ovario

Los ovarios sanos presentan en SHG una capa epitelial uniforme y colágeno bien organizado en su estroma , mientras que los anormales muestran un epitelio con células grandes y una estructura de colágeno alterada. [ 39 ] La relación r también se utiliza [ 41 ] para mostrar que la alineación de las fibrillas es ligeramente mayor en los tejidos cancerosos que en los tejidos normales.

cáncer de piel

SHG se combina, de nuevo, con 2PEF que se utiliza para calcular la relación:

METROFSI=(shg−tpef)/(shg+tpef){\displaystyle MFSI=({\text{shg}}-{\text{tpef}})/({\text{shg}}+{\text{tpef}})}

donde shg (o tpef) es el número de píxeles umbralizados en la imagen SHG (o 2PEF), [ 42 ] un MFSI alto significa una imagen SHG pura (sin fluorescencia). El MFSI más alto se encuentra en los tejidos cancerosos, [ 39 ] lo que proporciona un modo de contraste para diferenciarlos de los tejidos normales.

La SHG también se combinó con la Generación de Tercer Armónico (THG) para demostrar que la THG inversa es mayor en los tumores. [ 43 ]

Cáncer de páncreas

Los cambios en la ultraestructura del colágeno en el cáncer de páncreas pueden investigarse mediante fluorescencia multifotónica y SHIM con resolución de polarización. [ 44 ]

Otros tipos de cáncer

Se informó sobre la microscopía SHG para el estudio de cánceres de pulmón , colon , estroma esofágico y cuello uterino . [ 39 ]

detección de patologías

Las alteraciones en la organización o polaridad de las fibrillas de colágeno pueden ser signos de patología. [ 45 ] [ 46 ]

En particular, la alineación anisotrópica de las fibras de colágeno permitió diferenciar la dermis sana de las cicatrices patológicas en la piel . [ 47 ] Además, las patologías del cartílago, como la osteoartritis, pueden estudiarse mediante microscopía SHG con resolución de polarización. [ 48 ] [ 49 ] Posteriormente, SHIM se extendió al fibrocartílago ( menisco ). [ 50 ]

Ingeniería de tejidos

La capacidad de SHG para obtener imágenes de moléculas específicas puede revelar la estructura de un tejido determinado, material por material, y a diversas escalas (desde macroscópicas hasta microscópicas) mediante microscopía. Por ejemplo, el colágeno (tipo I) se visualiza específicamente a partir de la matriz extracelular (MEC) de las células, o cuando actúa como andamio o material conectivo en los tejidos. [ 51 ] SHG también revela la fibroína en la seda , la miosina en los músculos y la celulosa biosintetizada . Toda esta capacidad de imagen se puede utilizar para diseñar tejidos artificiales, apuntando a puntos específicos del tejido  : SHG puede medir cuantitativamente algunas orientaciones, la cantidad y la disposición del material. [ 51 ] Además, SHG acoplada a otras técnicas multifotónicas puede servir para monitorizar el desarrollo de tejidos diseñados, aunque la muestra sea relativamente delgada. [ 52 ] Por supuesto, finalmente se pueden utilizar como control de calidad de los tejidos fabricados. [ 52 ]

Estructura del ojo

La córnea , en la superficie del ojo , se considera que está formada por una estructura de colágeno similar a la madera contrachapada , debido a las propiedades de autoorganización del colágeno suficientemente denso . [ 53 ] Sin embargo, la orientación del colágeno en las láminas aún está en debate en este tejido . [ 54 ] La córnea con queratocono también puede visualizarse mediante SHG para revelar alteraciones morfológicas del colágeno . [ 55 ] Además, la microscopía de generación de tercer armónico (THG) se utiliza para visualizar la córnea , lo cual es complementario a la señal SHG, ya que los máximos de THG y SHG en este tejido suelen estar en lugares diferentes. [ 56 ]

Véase también

Fuentes

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Referencias

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