Mutagénesis por saturación de secuencias

La mutagénesis de saturación de secuencia ( SeSaM ) es un método de mutagénesis aleatoria quimioenzimática aplicado para la evolución dirigida de proteínas y enzimas . Es una de las técnicas de mutagénesis de saturación más comunes . En cuatro pasos de reacción basados ​​en PCR , se insertan nucleótidos de fosforotioato en la secuencia del gen , se escinden y los fragmentos resultantes se alargan con nucleótidos universales o degenerados . Estos nucleótidos se reemplazan luego por nucleótidos estándar, lo que permite una amplia distribución de mutaciones de ácidos nucleicos a lo largo de la secuencia del gen con preferencia por las transversiones y con un enfoque único en mutaciones puntuales consecutivas, ambas difíciles de generar por otras técnicas de mutagénesis. La técnica fue desarrollada por el profesor Ulrich Schwaneberg en la Universidad Jacobs de Bremen y la Universidad RWTH Aachen .

SeSaM se ha desarrollado para superar varias de las principales limitaciones que se presentan al trabajar con métodos de mutagénesis estándar basados ​​en técnicas de PCR propensas a errores (epPCR). Estas técnicas de epPCR dependen del uso de polimerasas y, por lo tanto, presentan limitaciones que resultan principalmente de la circunstancia de que solo se realizan sustituciones de ácidos nucleicos únicas, pero muy raramente consecutivas, y que estas sustituciones ocurren generalmente solo en posiciones específicas y favorecidas. Además, las transversiones de ácidos nucleicos son mucho menos probables que las transiciones y requieren polimerasas diseñadas específicamente con un sesgo alterado . ^{[ 1 ]} Estas características de los intercambios de ácidos nucleicos catalizados por epPCR junto con el hecho de que el código genético está degenerado disminuyen la diversidad resultante a nivel de aminoácidos . Las sustituciones sinónimas conducen a la preservación de aminoácidos o las mutaciones conservadoras con propiedades fisicoquímicas similares, como el tamaño y la hidrofobicidad, son muy prevalentes. ^{[ 2 ] [ 3 ]} Mediante la introducción no específica de bases universales en cada posición de la secuencia genética, SeSaM supera el sesgo de la polimerasa que favorece las sustituciones transitorias en posiciones específicas, pero abre la secuencia genética completa a una amplia gama de intercambios de aminoácidos. ^{[ 4 ]}

Durante el desarrollo del método SeSaM, se introdujeron varias modificaciones que permitieron la introducción simultánea de varias mutaciones. ^{[ 5 ]} Otro avance del método se logró mediante la introducción de bases degeneradas en lugar de la inosina universal y el uso de ADN polimerasas optimizadas, lo que aumentó aún más la proporción de transversiones introducidas. ^{[ 6 ]} Este método SeSaM-TV+ modificado permite, además, y favorece la introducción de dos intercambios de nucleótidos consecutivos, ampliando considerablemente el espectro de aminoácidos que pueden ser sustituidos.

Mediante varias optimizaciones, incluyendo la aplicación de una polimerasa quimérica mejorada en el Paso III del método SeSaM-TV-II ^{[ 7 ] [ 8 ]} y la adición de un nucleótido degenerado alternativo para la sustitución eficiente de bases de timina y citosina y una mayor frecuencia de mutación en SeSaM-P/R, ^{[ 9 ]} las bibliotecas generadas mejoraron aún más con respecto al número de transversiones y el número de mutaciones consecutivas se elevó a 2–4 ​​mutaciones consecutivas con una tasa de mutaciones consecutivas de hasta el 30%. ^{[ 10 ]}

El método SeSaM consta de cuatro pasos basados ​​en PCR que pueden ejecutarse en dos o tres días. Las partes principales incluyen la incorporación de nucleótidos de fosforotioato, la fragmentación química en estas posiciones, la introducción de bases universales o degeneradas y su reemplazo por nucleótidos naturales, insertando mutaciones puntuales.

Inicialmente, se insertan secuencias universales “SeSaM” mediante PCR con cebadores específicos que se unen delante y detrás del gen de interés. El gen de interés, junto con sus regiones flanqueantes, se amplifica para introducir estas secuencias SeSaM_fwd y SeSaM_rev y generar la plantilla para los pasos de PCR subsiguientes.

Estas plantillas generadas, denominadas plantillas fwd y rev, se amplifican mediante una reacción de PCR con una mezcla predefinida de fosforotioato y nucleótidos estándar para asegurar una distribución uniforme de las mutaciones insertadas a lo largo de todo el gen. Los productos de PCR del paso 1 se escinden específicamente en los enlaces fosforotioato, generando un conjunto de fragmentos de ADN monocatenario de diferentes longitudes a partir del cebador universal.

En el paso 2 de SeSaM, las cadenas sencillas de ADN se alargan mediante la adición de una o varias bases universales o degeneradas (según la modificación de SeSaM aplicada), catalizada por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Este paso es clave para introducir las mutaciones consecutivas características que modifican aleatoriamente codones completos.

Posteriormente, en el paso 3 se realiza una PCR que recombina los fragmentos de ADN monocatenario con la plantilla inversa de longitud completa correspondiente, generando el gen bicatenario de longitud completa que incluye bases universales o degeneradas en su secuencia.

Mediante la sustitución de las bases universales/degeneradas en la secuencia genética por nucleótidos estándar aleatorios en el paso 4 de SeSaM, se genera una amplia gama de secuencias genéticas completas con mutaciones de sustitución, incluyendo una alta carga de transversiones y mutaciones de sustitución subsiguientes.

SeSaM se utiliza para optimizar directamente las proteínas a nivel de aminoácidos, pero también para identificar preliminarmente las posiciones de aminoácidos para probar en mutagénesis de saturación para el intercambio de aminoácidos ideal. SeSaM se ha aplicado con éxito en numerosas campañas de evolución dirigida de diferentes clases de enzimas para su mejora hacia propiedades seleccionadas como celulasa para resistencia a líquidos iónicos, ^{[ 11 ]} proteasa con mayor tolerancia a detergentes, ^{[ 12 ]} glucosa oxidasa para aplicación analítica, ^{[ 13 ]} fitasa con mayor termoestabilidad ^{[ 14 ]} y monooxigenasa con eficiencia catalítica mejorada utilizando donantes de electrones alternativos. ^{[ 15 ]} SeSaM está protegido por patente por US770374 B2 en más de 13 países y es una de las tecnologías de plataforma de SeSaM-Biotech GmbH .