Cultivo de embriones de pollo sin cáscara

El cultivo de embriones de pollo sin cáscara es el proceso de cultivar embriones de pollo in vitro , sin sus cáscaras protectoras de huevo, para la observación científica. ^{[ 1 ]}

Los embriones de pollo y otros embriones aviares se han utilizado como modelos biológicos para visualizar las etapas de desarrollo embrionario con fines educativos y para realizar manipulaciones embriológicas. Mediante esta técnica, se pueden realizar observaciones, ya sea una malformación inducida por el efecto de teratógenos o inoculaciones con virus como el VIH o el herpes simple . Además, científicos de todo el mundo han creado métodos para la preservación de especies aviares en peligro de extinción y el desarrollo de aves transgénicas mediante el cultivo de cáscaras de huevo sustitutas. Los científicos han diseñado pruebas de administración de fármacos en embriones de mamíferos para tratar enfermedades degenerativas. La técnica se utilizó en la India para examinar las deformidades inducidas por glucosa en embriones de pollo. ^{[ 2 ]}

El primer ejemplo de un estudio formal que extrajo cultivos de embriones de pollo de sus cáscaras para su estudio fue Aristóteles en su obra Historia de los animales en el siglo IV a. C., quien observaba y diseccionaba embriones de pollo en diferentes etapas de desarrollo, anotando, entre otras cosas, la formación del corazón y otros órganos en intervalos de tiempo específicos después de la concepción. ^{[ 3 ]} Aunque Aristóteles no se centró en el cultivo de embriones de pollo fuera del huevo, esta obra es uno de los primeros estudios sistemáticos y formales sobre cultivos de embriones de pollo sin cáscara en diferentes etapas de desarrollo, así como uno de los primeros estudios formales sobre embriología y desarrollo animal en general.

En el siglo XVII, William Harvey realizó extensos estudios sobre embriología, en particular sobre embriones de pollo. Utilizando el proceso de epigénesis , observó y documentó las etapas del desarrollo embrionario del pollo. Si bien no cultivó embriones in vitro, abrió huevos en diversas etapas para observar el desarrollo y extrajo conclusiones sobre la circulación sanguínea y la formación de órganos. Su obra Sobre la generación de los animales, publicada en 1651, detalla sus estudios sobre el desarrollo de embriones de pollo, incluyendo sus ideas sobre la epigénesis y la circulación sanguínea. ^{[ 4 ]}

Marcello Malpighi, anatomista italiano, fue uno de los primeros científicos en utilizar un microscopio para estudiar embriones de pollo. Su obra de 1672, Sobre la formación del polluelo en el huevo, detallaba las primeras etapas del desarrollo del polluelo, que documentó mediante una serie de ilustraciones muy detalladas. Sus observaciones no se centraban en embriones sin cáscara propiamente dichos, pero representaron algunas de las primeras investigaciones sistemáticas sobre la embriología del pollo. Ilustró y documentó las etapas del desarrollo del embrión de pollo mediante microscopía, una de las primeras aplicaciones de esta herramienta en embriología. ^{[ 5 ]}

Christian Heinrich Pander (1794–1865): Los estudios de Pander a principios del siglo XIX, publicados en 1817, se centraron en el desarrollo del embrión de pollo. Introdujo el concepto de capas germinales, describiendo cómo se formaban el ectodermo , el mesodermo y el endodermo en el embrión de pollo. Su trabajo sentó las bases para estudios embriológicos posteriores y fue influyente en la biología del desarrollo. Su trabajo de 1817, Dissertatio Inauguralis quaedam de Ovi Avium atque Hominis Incubatione [Disertación sobre la incubación del huevo aviar y los humanos]. Würzburg: Universidad de Würzburg . Esta disertación introdujo el concepto de capas germinales, describiendo el ectodermo, el mesodermo y el endodermo en el pollo en desarrollo.

Karl Ernst von Baer se basó en el trabajo de Pander y a menudo se le considera el "padre de la embriología". Sus estudios en la década de 1820 se centraron en la embriología de los vertebrados, incluyendo la del polluelo, y formuló las leyes de von Baer , ​​que describen las etapas del desarrollo. No utilizó técnicas de disección de huevos sin cáscara, sino que diseccionó huevos en diferentes etapas para observar el desarrollo. En 1828, su obra Sobre la historia del desarrollo de los animales: observación y reflexión sentó las bases de la embriología comparada y describió las etapas del desarrollo, incluyendo sus célebres leyes del desarrollo.

Si bien estos estudios no incluyeron el cultivo in vitro completo de embriones de pollo sin cáscara, fueron significativos para la embriología, ya que marcaron avances en la observación y comprensión de los procesos de desarrollo. Los métodos de cultivo de embriones de pollo sin cáscara surgieron recién en el siglo XX, gracias a una mejor comprensión de las necesidades ambientales para el desarrollo de los embriones fuera de la cáscara. Estos avances sentaron las bases para el cultivo práctico de embriones sin cáscara, que surgió con la llegada de las técnicas de laboratorio modernas.

Los intentos de cultivar el embrión in vitro y estudiar la dinámica activa del desarrollo embrionario fuera del huevo comenzaron con McWhorter y Whipple en 1912. Adaptando un aparato que citaron de un artículo de Harrison de 1907 (quien estudiaba embriones de rana in vitro), el diseño de su aparato se adaptó para estudiar el desarrollo del embrión de pollo en la etapa de blastodermo in vitro, y representó uno de los primeros intentos de comprender la embriogénesis del pollo fuera del huevo. ^{[ 6 ]} Su trabajo sentó las bases fundamentales de la transferencia de técnicas de cultivo in vitro de las ranas a la embriología del pollo sin cáscara y proporcionó un importante punto de referencia histórico.

El estudio de Alexis L. Romanoff de 1943 destaca especialmente su trabajo y sus intentos por aumentar el tiempo de embriogénesis in vitro. Tras haber investigado previamente los efectos de la radiación electromagnética en embriones de pollo, Romanoff describe una metodología que facilitaba la manipulación de embriones fuera de la cáscara hasta la etapa de desarrollo de 48 horas. La técnica consiste en romper el saco protector, al que denominó saco albuminoso, de manera que la yema quede sumergida en la clara. Todo ello se coloca dentro de un anillo de vidrio y un recipiente para mantener la posición, con una tapa de vaso para evitar la evaporación excesiva del contenido del huevo. Finalmente, todo se introduce en una incubadora con un suelo elevado de malla metálica para asegurar un suministro de aire adecuado, lo que favorece el desarrollo del embrión en un entorno óptimo. El método de Romanoff introdujo una forma simplificada de estudiar embriones de pollo fuera de la cáscara, centrándose en el control ambiental para mantener el crecimiento. Esta técnica mejoró la observación embrionaria en etapas tempranas y perfeccionó la manipulación de las diferentes etapas de desarrollo del pollo. ^{[ 7 ]}

En 1961, el trabajo de Williams y Boone exploró los desafíos y limitaciones para mantener el crecimiento de embriones de pollo en un entorno sin cáscara, o ex ovo. Específicamente, observaron que el crecimiento del embrión de pollo podía inhibirse significativamente bajo ciertas condiciones in vitro, enfatizando la importancia de factores como el acceso a nutrientes, la estabilidad ambiental y el soporte estructural, que son más difíciles de replicar fuera de la cáscara del huevo. ^{[ 8 ]} El estudio contribuyó a comprender las limitaciones específicas de los cultivos sin cáscara al identificar las condiciones que inhiben el crecimiento. Esto sirvió de base para el artículo fundamental de Boone dos años después, en 1963, en el que optimizó las soluciones nutritivas, ajustó las técnicas de incubación y refinó los métodos de cultivo sin cáscara, lo que resultó crucial para estudios posteriores centrados en el desarrollo del embrión aviar fuera de la cáscara del huevo. ^{[ 9 ]} Ese artículo, junto con el de Quisenberry y Dillon en 1962, ^{[ 10 ]} marcó los primeros ejemplos de crecimiento embrionario sin cáscara que duró seis días.

Según un protocolo redactado por CJ Fisher en 1993, ella atribuye otra mejora importante al sótano de un estudiante de secundaria llamado Bruce Dunn en 1974, que utilizaba una eslinga de plástico y que fue simplificada por Castellot et al. en 1982 mediante el uso de vasos desechables. ^{[ 1 ]} Como informó CJ Fisher,

Los primeros intentos de cultivar embriones de pollo fuera de sus cáscaras (Boone, 1963; Quisenberry y Dillon, 1962) tuvieron un éxito limitado. Bruce Dunn (1974), un estudiante de secundaria que trabajaba en un laboratorio improvisado en un sótano, ideó un método para cultivar embriones de pollo en soportes de plástico. Trabajando con Boone, Ramsey y Dunn mejoraron los métodos de cultivo de embriones sin cáscara (Dunn y Boone, 1976; Ramsey y Boone, 1972). Castellot et al. (1982) simplificaron aún más el método sustituyendo los trípodes de plástico por vasos desechables para alimentos calientes ("pollito en vaso"). ^{[ 1 ]}

Los avances específicos logrados por el artículo de Ramsey y Boone de 1972 consistieron en el desarrollo de incubadoras con características destinadas a controlar la temperatura, la atmósfera, la humedad y reducir la exposición bacteriana. La construcción se realizó con madera contrachapada y aislamiento de poliestireno de 2,5 cm , y ventanas de visualización de plexiglás y vidrio para una mejor visibilidad. El sistema de flujo de aire permitía la entrada de aire por la parte superior e inferior y su salida por los laterales tras ser calentado por un ventilador. En el interior, una cámara interna controlada albergaba hasta 36 embriones, colocados a 15 cm de distancia entre sí para una óptima circulación del aire. El sistema de control de temperatura mantenía la temperatura entre 37,8 y 37,9 °C mediante un termistor-regulador, con monitorización en tiempo real a nivel embrionario. El estudio marcó un hito al demostrar que los embriones de pollo podían sobrevivir hasta 18 días en cáscaras abiertas dentro de esta incubadora. ^{[ 11 ]}

Las mejoras específicas de Dunn y Boone en 1976 perfeccionaron la técnica para el cultivo in vitro de embriones de pollo, permitiendo un crecimiento de tres a 21 días de incubación total (tres días en la cáscara seguidos de 18 días en cultivo). Este método mejorado dio como resultado un tiempo medio de supervivencia de 18 días en los embriones cultivados, alcanzando la etapa 41 de Hamburger-Hamilton , que corresponde a una etapa de desarrollo de 15 días en la incubación natural. El estudio detalla cómo los embriones cultivados in vitro mostraron un desarrollo físico comparable (por ejemplo, peso húmedo y seco, longitud de los dedos) con los embriones incubados naturalmente en etapas correspondientes. Sin embargo, los embriones cultivados ex ovo mostraron cierto grado de retraso en el crecimiento en comparación con sus homólogos in ovo. Su método proporcionó una forma de analizar el desarrollo embrionario hasta etapas posteriores, lo que permitió estudios más complejos sobre la fisiología y el desarrollo del embrión de pollo sin la cáscara. Los hallazgos también destacaron posibles factores que contribuyen a las limitaciones del crecimiento in vitro, lo que permitió perfeccionar aún más las condiciones de cultivo embrionario. ^{[ 12 ]}

En 1988, el artículo de MM Perry describió el primer desarrollo exitoso de un embrión de pollo desde una etapa temprana hasta la eclosión completamente fuera de la cáscara del huevo. El trabajo de Perry introdujo un sistema completo de cultivo in vitro que replicaba cuidadosamente las condiciones dentro de una cáscara de huevo natural. El sistema incluía el suministro controlado de oxígeno, humedad y nutrientes, esenciales para la supervivencia y el crecimiento del embrión a través de todas las etapas de desarrollo. El sistema de cultivo de Perry marcó un hito en la embriología aviar al lograr el desarrollo completo, y su técnica allanó el camino para el estudio de embriones de pollo en condiciones controladas. ^{[ 13 ]}

Tras el éxito de la embriogénesis de pollos sin cáscara a término en 1988, con el cambio de siglo se produjo un cambio de enfoque hacia la optimización de este protocolo in vitro mediante un mayor énfasis en los nutrientes, como el calcio, con atención continua a la aireación y otros controles ambientales. Se estableció una técnica viable para todas las etapas del proceso de desarrollo completo. Comenzó a acelerarse una importante convergencia entre los cultivos de embriones de pollo y otros cultivos de embriones, como el de codorniz, por ejemplo. Al utilizar cáscaras de huevo de gallina como recipientes, Kamihira et al. en 1998 descubrieron que las condiciones enriquecidas con oxígeno mejoraban la viabilidad durante el cultivo en etapa intermedia, aumentando la tasa de eclosión al 30%, y que la adición de lactato de calcio , junto con la aireación con oxígeno, aumentaba aún más la tasa de eclosión al 80%, abordando las deficiencias de calcio en los cultivos sin cáscara. ^{[ 14 ]} Aunque este artículo utiliza el cultivo de embriones de pollo y solo la cáscara de pollo como recipiente artificial para el cultivo de embriones de codorniz, se ha citado como un estudio fundamental para artículos más recientes que estudian aspectos similares en cultivos de embriones de pollo sin cáscara. ^{[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 2 ]}

Se ha comenzado a prestar mayor atención al calcio y su función. En 2014, Tahara y Obara transfirieron embriones de pollo al recipiente de cultivo después de 55-56 h de incubación; más del 90 % de los embriones sobrevivieron hasta el día 17, cuando se utilizó una película de polimetilpenteno como recipiente de cultivo con suplementación de lactato de calcio y agua destilada . La aireación con oxígeno puro a los embriones supervivientes a partir del día 17 produjo una tasa de eclosión del 57,1 % (8 de 14). Por lo tanto, logramos con éxito una alta tasa de eclosión con este método en el cultivo de embriones de pollo utilizando un recipiente artificial. ^{[ 2 ]} Incluso artículos centrados exclusivamente en la optimización de un entorno artificial, como los novedosos diseños de huevos artificiales de vidrio cuadrados de 2015 hechos de vidrio y cubos exactos para mejorar la medición y la visibilidad, muestran este deseo de implementar el calcio para obtener mejores resultados. ^{[ 18 ]}

Dunn aportó más evidencia del calcio en el desarrollo en 2023; ^{[ 19 ]} al año siguiente, demostró por primera vez que huevos no incubados se incubaron con éxito en un cultivo sin cáscara durante las primeras 69-70 horas. Utilizó un nuevo aparato de plataforma giratoria. ^{[ 20 ]} Junto con las mejoras en el estudio visual y la dinámica del desarrollo mediante películas transparentes y configuraciones más elaboradas, ^{[ 15 ]} los estudios modernos sobre cultivos de embriones de pollo sin cáscara siguen centrados en la optimización del entorno y los nutrientes.

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