ARN de horquilla corta

Un ARN de horquilla corta o ARN de horquilla pequeña ( shRNA /Vector de Horquilla) es una molécula de ARN artificial con una horquilla cerrada que puede usarse para silenciar la expresión de genes diana mediante interferencia de ARN (ARNi). ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} La expresión de shRNA en células se logra típicamente mediante la administración de plásmidos o a través de vectores virales o bacterianos . El shRNA es un mediador ventajoso de la ARNi debido a su tasa relativamente baja de degradación y recambio. Sin embargo, requiere el uso de un vector de expresión , lo que puede causar efectos secundarios en aplicaciones médicas. ^{[ 4 ]}

La elección del promotor es fundamental para lograr una expresión robusta de shRNA. Inicialmente, se utilizaron promotores de la polimerasa III, como U6 y H1; sin embargo, estos promotores carecen de control espacial y temporal. ^{[ 4 ]} Por ello, se ha producido un cambio hacia el uso de promotores de la polimerasa II , que son inducibles, para regular la expresión de shRNA.

La expresión de shRNA en las células se puede obtener mediante la introducción de plásmidos o a través de vectores virales o bacterianos .

La introducción de plásmidos en las células mediante transfección para obtener la expresión de shRNA puede realizarse in vitro utilizando reactivos disponibles comercialmente . Sin embargo, este método no es aplicable in vivo y, por lo tanto, su utilidad es limitada.

El uso de un vector bacteriano para obtener la expresión de shRNA en células es un enfoque relativamente reciente. Se basa en investigaciones que demuestran que la Escherichia coli recombinante , que contiene un plásmido con shRNA, administrada a ratones, puede suprimir la expresión del gen diana en el epitelio intestinal. ^{[ 5 ]} Este enfoque se utilizó en 2012 en ensayos clínicos para tratar a pacientes con poliposis adenomatosa familiar. ^{[ 6 ]}

Se pueden utilizar diversos vectores virales para obtener la expresión de shRNA en células, incluidos los virus adenoasociados (AAV), los adenovirus y los lentivirus . En el caso de los virus adenoasociados y los adenovirus, los genomas permanecen episomales. Esto es ventajoso, ya que se evita la mutagénesis por inserción. Sin embargo, es desventajoso, pues la descendencia de la célula perderá el virus rápidamente mediante la división celular, a menos que la célula se divida muy lentamente. Los AAV se diferencian de los adenovirus en que se han eliminado los genes virales y tienen una capacidad de empaquetamiento reducida. Los lentivirus se integran en secciones de cromatina transcripcionalmente activa y, por lo tanto, se transmiten a las células hijas. Con este método, existe un mayor riesgo de mutagénesis por inserción; no obstante, este riesgo puede reducirse utilizando un lentivirus deficiente en integrasa. ^{[ 7 ]}

Una vez que el vector se ha integrado en el genoma del huésped, el shRNA se transcribe en el núcleo mediante la polimerasa II o la polimerasa III, según el promotor elegido. El producto imita al pri-microARN (pri-miRNA) y es procesado por Drosha . El pre-shRNA resultante es exportado del núcleo por Exportina 5. Este producto es procesado por Dicer y cargado en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). La cadena sentido (pasajera) se degrada. La cadena antisentido (guía) dirige al RISC hacia el ARNm que tiene una secuencia complementaria. En caso de complementariedad perfecta, el RISC corta el ARNm. En caso de complementariedad imperfecta, el RISC reprime la traducción del ARNm. En ambos casos, el shRNA produce el silenciamiento del gen diana.

Debido a la capacidad del shRNA para proporcionar un silenciamiento génico específico y duradero, ha habido un gran interés en su uso para aplicaciones de terapia génica. A continuación, se describen tres ejemplos de terapias basadas en shRNA.

Gradalis, Inc. desarrolló la vacuna FANG, que se utiliza en el tratamiento de cánceres avanzados. FANG se basa en un shRNA bifuncional (bi-shRNA) contra los factores de crecimiento transformantes (TGF) β1 y β2 inmunosupresores. ^{[ 9 ]} Se obtuvieron células tumorales autólogas de pacientes y se introdujo un plásmido que codifica el shRNA bifuncional y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) ex vivo mediante electroporación. Posteriormente, estas células se irradiaron y se volvieron a inyectar en el paciente.

Marina Biotech desarrolló CEQ508, un fármaco utilizado para tratar la poliposis adenomatosa familiar. CEQ508 utiliza un vector bacteriano para administrar shRNA contra la β-catenina.

Gradalis, Inc. desarrolló el shRNA bifuncional STMN1 (pbi-shRNA STMN1), que se utiliza para tratar cánceres avanzados y/o metastásicos. Este pbi-shRNA STMN1 actúa contra la estatmina 1 y se administra intratumoralmente mediante la tecnología de lipoplexos (LP) de vesículas invaginadas bilamelares (BIV) .

Las terapias basadas en shRNA suelen presentar varios desafíos. El más importante es su administración. El shRNA se administra generalmente mediante un vector, y aunque suelen ser eficaces, plantean importantes problemas de seguridad. En particular, los enfoques de terapia génica basados ​​en virus han demostrado ser peligrosos en ensayos clínicos anteriores. En la primera generación de terapia génica retroviral, algunos pacientes tratados con vectores virales para el síndrome de Wiskott-Aldrich desarrollaron leucemia aguda de células T. Se determinó que esto se debía a la ubicación de inserción del vector viral. ^{[ 10 ]} La posible sobresaturación del complejo RISC también es un problema. Si el shRNA se expresa a niveles demasiado altos, la célula podría no ser capaz de procesar correctamente el ARN endógeno, lo que podría causar problemas importantes. Otro desafío es la posibilidad de que el paciente desarrolle una respuesta inmunitaria contra la terapia. ^{[ 11 ]} Finalmente, podrían producirse efectos fuera de objetivo y el shRNA podría silenciar otros genes no deseados. Para desarrollar nuevas terapias exitosas basadas en shRNA, es fundamental tener en cuenta todos estos desafíos.

• ARN de interferencia pequeño
• VIRsiRNAdb