Variabilidad de células individuales

Las células con genomas idénticos pueden variar en la expresión de sus genes debido a diferencias en su función especializada en el cuerpo, su momento en el ciclo celular , su entorno, así como al ruido y a factores estocásticos . Por lo tanto, la medición precisa de la expresión génica en células individuales permite a los investigadores comprender mejor estos aspectos críticos de la biología celular. Por ejemplo, los primeros estudios de la expresión génica en células individuales de embriones de mosca de la fruta permitieron a los científicos descubrir patrones o gradientes regularizados de transcripción génica específica durante diferentes etapas del crecimiento, lo que permitió una comprensión más detallada del desarrollo a nivel de ubicación y tiempo. Otro fenómeno en la expresión génica que solo se pudo identificar a nivel de célula individual es la expresión génica oscilatoria, en la que un gen se expresa de forma intermitente.

La expresión génica de células individuales se suele analizar mediante RNA-seq . Después de aislar la célula, el protocolo RNA-seq suele constar de tres pasos: ^{[ 4 ]} el ARN se transcribe inversamente a cDNA , el cDNA se amplifica para que haya más material disponible para el secuenciador y el cDNA se secuencia .

Una población de organismos unicelulares como las bacterias suele presentar ligeras variaciones en su secuencia de ADN debido a mutaciones adquiridas durante la reproducción. En un mismo ser humano, las células individuales suelen tener genomas idénticos, aunque existen excepciones interesantes, como las células B , que presentan variaciones en su ADN que les permiten generar diferentes anticuerpos para unirse a la variedad de patógenos que pueden atacar el organismo. Medir las diferencias y la tasa de cambio en el contenido de ADN a nivel unicelular puede ayudar a los científicos a comprender mejor cómo los patógenos desarrollan resistencia a los antibióticos, por qué el sistema inmunitario a menudo no puede producir anticuerpos contra virus que mutan rápidamente, como el VIH, y otros fenómenos importantes.

Existen muchas tecnologías para la secuenciación de genomas, pero están diseñadas para utilizar ADN de una población de células en lugar de una sola célula. El principal desafío para la secuenciación del genoma de una sola célula es hacer múltiples copias (amplificar) del ADN para que haya suficiente material disponible para el secuenciador, un proceso llamado amplificación del genoma completo (WGA). Los métodos típicos para WGA consisten en: ^{[ 5 ]} (1) Amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) en la que múltiples cebadores se unen al ADN, las polimerasas copian el ADN y eliminan otras polimerasas, liberando hebras que pueden ser procesadas por el secuenciador, (2) métodos basados ​​en PCR , o (3) alguna combinación de ambos.

Las células varían en los metabolitos que contienen, que son los compuestos intermedios y los productos finales de reacciones bioquímicas complejas que mantienen la célula. Las células genéticamente idénticas en diferentes condiciones y entornos pueden usar diferentes vías metabólicas para mantenerse. Al medir los metabolitos presentes, los científicos pueden inferir las vías metabólicas utilizadas y obtener información útil sobre el estado de la célula. Un ejemplo de esto se encuentra en el sistema inmunitario, donde las células CD4+ pueden diferenciarse en células Th17 o TReg (entre otras posibilidades), las cuales dirigen la respuesta del sistema inmunitario de diferentes maneras. Las células Th17 estimulan una fuerte respuesta inflamatoria, mientras que las células TReg estimulan el efecto opuesto. Las primeras tienden a depender mucho más de la glucólisis , ^{[ 6 ]} debido a sus mayores demandas de energía.

Para perfilar el contenido metabólico de una célula, los investigadores deben identificar la célula de interés en la población más amplia, aislarla para su análisis, inhibir rápidamente las enzimas y detener los procesos metabólicos en la célula, y luego utilizar técnicas como RMN , espectrometría de masas , microfluídica y otros métodos para analizar el contenido de la célula. ^{[ 7 ]}

De forma similar a la variación en el metaboloma, las proteínas presentes en una célula y su abundancia pueden variar de célula a célula en una población que, por lo demás, es similar. Si bien la transcripción y la traducción determinan la cantidad y variedad de proteínas producidas, estos procesos son imprecisos, y las células poseen diversos mecanismos que pueden modificar o degradar las proteínas, lo que permite una varianza en el proteoma que puede no explicarse por la varianza en la expresión génica. Además, las proteínas tienen muchas otras características importantes además de su simple presencia o ausencia, como si han sufrido modificaciones postraduccionales como la fosforilación , o si están unidas a moléculas de interés. La variación en la abundancia y las características de las proteínas tiene implicaciones para campos como la investigación y la terapia del cáncer, donde un fármaco dirigido a una proteína en particular puede variar en su impacto debido a la variabilidad en el proteoma, ^{[ 8 ]} o variar en su eficacia debido al fenómeno biológico más amplio de la heterogeneidad tumoral .

La citometría, los métodos de superficie y las tecnologías de microfluídica son las tres clases de herramientas comúnmente utilizadas para perfilar los proteomas de células individuales. ^{[ 9 ]} La citometría permite a los investigadores aislar células de interés y teñir de 15 a 30 proteínas para medir su ubicación y/o abundancia relativa. ^{[ 9 ]} Se han desarrollado técnicas de ciclado de imágenes para medir la abundancia y distribución de múltiples objetivos en muestras de biopsia y tejidos. En estos métodos, de 3 a 4 objetivos se tiñen con anticuerpos marcados con fluorescencia, se obtienen imágenes y luego se eliminan sus fluoróforos por una variedad de medios, incluyendo químicas basadas en oxidación ^{[ 10 ]} o, más recientemente, métodos de conjugación de anticuerpos-ADN, ^{[ 11 ]} lo que permite teñir objetivos adicionales en ciclos posteriores; en algunos métodos se han visualizado hasta 60 objetivos individuales. ^{[ 12 ]} Para los métodos de superficie, los investigadores colocan una sola célula en una superficie recubierta con anticuerpos, que luego se unen a las proteínas secretadas por la célula y permiten medirlas. ^{[ 9 ]} Los métodos de microfluídica para el análisis del proteoma inmovilizan células individuales en un microchip y utilizan tinción para medir las proteínas de interés, o anticuerpos para unirse a las proteínas de interés.

Las células de una población similar pueden variar en tamaño y morfología debido a diferencias funcionales, cambios metabólicos o simplemente por encontrarse en distintas fases del ciclo celular u otros factores. Por ejemplo, las células madre pueden dividirse asimétricamente ^{[ 13 ]} , lo que significa que las dos células hijas resultantes pueden tener destinos diferentes (funciones especializadas) y diferir entre sí en tamaño o forma. Los investigadores que estudian el desarrollo pueden estar interesados ​​en rastrear las características físicas de la progenie individual en una población en crecimiento para comprender cómo las células madre se diferencian en un tejido u organismo complejo a lo largo del tiempo.

La microscopía se puede utilizar para analizar el tamaño y la morfología celular mediante la obtención de imágenes de alta calidad a lo largo del tiempo. Estas imágenes suelen contener una población de células, pero se pueden aplicar algoritmos para identificar y rastrear células individuales en múltiples imágenes. ^{[ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]} Los algoritmos deben ser capaces de procesar gigabytes de datos para eliminar el ruido y resumir las características relevantes para la pregunta de investigación planteada. ^{[ 17 ]}

Las células individuales de una población suelen encontrarse en diferentes fases del ciclo celular. Los científicos que deseen comprender las características de la célula en un punto específico del ciclo tendrían dificultades al utilizar estimaciones a nivel poblacional, ya que estas promediarían las mediciones de células en distintas etapas. Asimismo, comprender el ciclo celular en células individuales enfermas, como las de un tumor, es fundamental, dado que suelen presentar un ciclo muy diferente al de las células sanas. El análisis unicelular de las características del ciclo celular permite a los científicos comprender estas propiedades con mayor detalle.

La variabilidad del ciclo celular puede estudiarse mediante varios de los métodos descritos anteriormente. Por ejemplo, las células en fase G2 serán bastante grandes (ya que están a punto de dividirse en dos) y pueden identificarse mediante protocolos para medir el tamaño y la forma celular. Las células en fase S copian sus genomas y pueden identificarse mediante protocolos para teñir el ADN y medir su contenido por citometría de flujo o microscopía de fluorescencia cuantitativa, o mediante sondas para genes que se expresan en altos niveles en fases específicas del ciclo celular.