celda de longitud de trayectoria variable

Una celda de longitud de trayectoria variable es un portamuestras utilizado para espectroscopia ultravioleta-visible o espectroscopia infrarroja que tiene una longitud de trayectoria que se puede variar para cambiar la absorbancia sin cambiar la concentración de la muestra. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

La ley de Beer-Lambert establece que existe una dependencia logarítmica entre la transmitancia (o transmisividad), T, de la luz a través de una sustancia y el producto del coeficiente de absorción de la sustancia, α, y la distancia que recorre la luz a través del material (es decir, la longitud del camino óptico), ℓ. El coeficiente de absorción , a su vez, puede expresarse como el producto de la absortividad molar del absorbente, ε, y la concentración c de las especies absorbentes en el material, o bien como la sección transversal de absorción , σ, y la densidad (numérica) N de los absorbentes. (Véase el enlace a la ley de Beer-Lambert para la derivación completa).

${\displaystyle A=\varepsilon \ell c}$

La espectroscopia con celda de longitud de trayectoria variable aprovecha la ley de Beer-Lambert para determinar las concentraciones de diversas soluciones . Conociendo la absortividad molar del material y variando la longitud de la trayectoria, se puede graficar la absorción en función de dicha longitud. Véase la gráfica de ejemplo a la derecha:

Al realizar una regresión lineal del gráfico lineal anterior, se puede obtener una expresión que relaciona la absorbancia, A, la pendiente, m, la longitud del camino óptico y la concentración.

Se puede derivar una ecuación lineal de dos variables,

${\displaystyle y=mx+b}$

igualando en términos de unidades obtenemos,

${\displaystyle A=m\ell +b}$

Dado que la pendiente de la línea está en unidades de Abs/Longitud del camino, la pendiente se puede expresar como:

${\displaystyle m={A \over \ell }}$

Al insertar en la Ley de Beer obtenemos,

${\displaystyle m=\varepsilon c}$

Esta es la ecuación de espectroscopia de pendiente.

Las técnicas de longitud de trayectoria variable pueden aplicarse en cualquier situación donde se pueda aplicar la ley de Beer. Proporcionan un método analítico que compensa las pequeñas variaciones en la consistencia de la preparación de la muestra. Además, permiten calcular concentraciones sin necesidad de curvas de calibración ni diluciones seriadas de las muestras.

La espectroscopia de absorción de longitud de trayectoria variable se utiliza habitualmente cuando se requiere una alta reproducibilidad de los datos. Esto se aplica a campos como la medicina , la biotecnología , la farmacología y el descubrimiento de fármacos . Resulta especialmente útil en la etapa de purificación de proteínas en biotecnología, donde se necesitan concentraciones precisas de diversas proteínas, o en cristalografía .

Determinar la proporción relativa de proteína a ADN es una práctica común y se puede calcular hallando la pendiente en los picos de absorción correspondientes y calculando su cociente. Este método se utiliza para determinar la pureza de una muestra que contiene estos dos tipos de moléculas.

En la espectroscopia ultravioleta-visible, o en la espectroscopia en general , se utiliza una cubeta de 1  cm de longitud de paso para medir las muestras. La cubeta se llena con la muestra, se hace pasar luz a través de ella y se registran las lecturas de intensidad. La técnica de espectroscopia de pendiente se puede aplicar utilizando los mismos métodos que en la espectroscopia de absorción . Con la llegada de las etapas lineales precisas , la espectroscopia de absorción de longitud de paso variable se puede aplicar fácilmente de forma experimental.

Otros métodos experimentales incluyen el uso de cocientes de pendientes para construir espectros de coeficientes de extinción. Esto es posible porque la aplicación de la espectroscopia de pendientes permite al científico mantener constantes los niveles de concentración y variar las longitudes de trayectoria.

La espectroscopia de absorción de longitud de trayectoria variable utiliza una pendiente determinada para calcular la concentración. Como se mencionó anteriormente, esta pendiente es el producto de la absortividad molar y la concentración. Dado que el valor real de absorbancia se toma en múltiples puntos de datos a intervalos iguales, generalmente no es necesario restar el fondo. La imagen de la derecha muestra una gráfica lineal con los datos corregidos del fondo y los datos sin corregir.

Esto demuestra que los valores de absorbancia en la gráfica se compensan en igual medida y que la pendiente de ambas gráficas es la misma. Por lo tanto, la concentración calculada a partir de ambas gráficas es igual. Otros componentes escalares que contribuyen a la absorbancia de una muestra determinada, como los contaminantes en la cubeta o un material diferente de la cubeta, también se promedian durante la medición de la pendiente.

Esta técnica también es aplicable para mediciones en línea en aplicaciones de TFF y cromatografía .

• Espectroscopia aplicada

• Thakkar, Santosh V.; Allegre, Kevin M.; Joshi, Sangeeta B.; Volkin, David B.; Middaugh, C. Russell (2012). "Una aplicación de la espectroscopia ultravioleta para estudiar interacciones en soluciones de proteínas a altas concentraciones". Journal of Pharmaceutical Sciences . 101 (9): 3051– 3061. Bibcode : 2012JPhmS.101.3051T . doi : 10.1002/jps.23188 . ISSN 0022-3549 . PMID 22581726 .  
• Scott Huffman, Keyur Soni y Joe Ferraiolo Determinación de la concentración de proteínas mediante espectroscopia UV-Vis: Validación e implementación de mediciones de pendiente utilizando tecnología de longitud de trayectoria variable para septiembre de 2014 http://www.bioprocessintl.com/manufacturing/antibody-non-antibody/uv-vis-based-determination-protein-concentration-validating-implementing-slope-measurements-using-variable-pathlength-technology/