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ARN condicional pequeño

Un ARN condicional pequeño ( scRNA ) es una molécula o complejo de ARN pequeño (típicamente de menos de aproximadamente 100 nt ) diseñado para interactuar y cambiar de conformac...

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Un ARN condicional pequeño ( scRNA ) es una molécula o complejo de ARN pequeño (típicamente de menos de aproximadamente 100 nt ) diseñado para interactuar y cambiar de conformación de forma condicional en respuesta a señales moleculares específicas, con el fin de realizar la transducción de señales in vitro , in situ o in vivo . [ 1 ]

En ausencia de moléculas de entrada afines, los scRNA se diseñan para coexistir de forma metaestable o estable sin interactuar. La detección de las entradas afines inicia cambios conformacionales posteriores de uno o más scRNA que conducen a la generación de la señal de salida deseada. La señal de salida puede estar destinada a leer el estado de los circuitos biológicos endógenos (por ejemplo, mapear la expresión génica para la investigación biológica o el diagnóstico médico) [ 2 ] o a regular el estado de los circuitos biológicos endógenos (por ejemplo, perturbar la expresión génica para la investigación biológica o el tratamiento médico) [ 1 ] . Las secuencias de scRNA pueden programarse para reconocer diferentes entradas o para activar diferentes salidas [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] logrando incluso selectividad de secuencia de un solo nucleótido [ 3 ] . La transducción de señales de scRNA explota principios de las disciplinas emergentes de la nanotecnología dinámica de ARN, la programación molecular y la biología sintética .

Figura 1. Amplificación de señal fluorescente mediante ARN condicionales pequeños. Los ARNc fluorescentes metaestables se autoensamblan en polímeros de amplificación fluorescente al detectar un ARN iniciador cognado. El iniciador I se nuclea con la horquilla H1 mediante el apareamiento de bases con el anclaje monocatenario '1', mediando una migración de ramificación de 3 vías que abre la horquilla para formar el complejo I·H1 que contiene el segmento monocatenario '3*-2*'. Este complejo se nuclea con la horquilla H2 mediante el apareamiento de bases con el anclaje '3', mediando una migración de ramificación que abre la horquilla para formar el complejo I·H1·H2 que contiene el segmento monocatenario '2*-1*'. De este modo, se regenera la secuencia iniciadora, proporcionando la base para una reacción en cadena de pasos de polimerización alternados de H1 y H2. Las estrellas rojas indican fluoróforos. Imagen de Choi et al. 2010; [ 2 ] utilizada con permiso de Nature Publishing Group.

Ejemplos de transducción de señales de ARNc

Se han diseñado scRNAs marcados con fluoróforos para transducir entre la detección de ARNm diana y la generación de polímeros de amplificación fluorescentes brillantes in situ (Figura 1). [ 2 ] En este contexto, la transducción de señales de scRNA permite el mapeo multiplexado de la expresión de ARNm dentro de embriones de vertebrados intactos (Figura 2). [ 2 ] Se han diseñado scRNAs para realizar la transducción de forma y secuencia para producir condicionalmente un sustrato de Dicer dirigido al ARNm diana de silenciamiento Y tras la detección de un ARNm diana de detección independiente X, con el procesamiento posterior de Dicer que produce un ARN de interferencia pequeño ( siRNA ) dirigido al ARNm Y para su destrucción (Figura 3). [ 1 ] En este contexto, la transducción de señales de scRNA proporciona un paso hacia la implementación de la interferencia de ARN condicional (Figura 4).

Figura 2. Mapeo simultáneo de cinco ARNm diana diferentes dentro de un embrión de pez cebra intacto mediante amplificación de señal de scRNA y microscopía confocal. Las sondas de ARN complementarias a los ARNm diana desencadenan reacciones en cadena en las que los scRNA marcados con fluoróforos se autoensamblan en polímeros de amplificación fluorescentes unidos. La programabilidad y la selectividad de secuencia de estas cascadas de amplificación permiten que cinco amplificadores de scRNA operen de forma independiente al mismo tiempo en la misma muestra, tiñendo cada uno la expresión de uno de los cinco ARNm diana. Barra de escala: 50 μm. Imagen de Choi et al. 2010; [ 2 ] utilizada con permiso de Nature Publishing Group.
Figura 3. Formación del sustrato condicional de Dicer mediante transducción de forma y secuencia con pequeños ARN condicionales. El scRNA A·B detecta el ARNm diana X (que contiene la subsecuencia 'abc'), lo que conduce a la producción del sustrato de Dicer B·C que se dirige al ARNm diana Y (que contiene la subsecuencia independiente 'wxyz'). Los scRNA A·B y C son estables en ausencia de X. A intercambia B por X (paso 1) mediante migración de rama de 3 vías mediada por un anclaje y disociación espontánea. B se ensambla con C (paso 2) mediante nucleación de bucle/anclaje y migración de rama de 3 vías para formar el sustrato de Dicer B·C. Las modificaciones químicas (2′OMe-ARN) previenen la degradación: A y parte de C (esqueleto discontinuo). Imagen de Hochrein et al. 2013; [ 1 ] utilizada con permiso de la American Chemical Society.
Figura 4. El ARN de interferencia condicional (si el gen X se transcribe, se silencia el gen Y independiente) proporciona un marco conceptual para ejercer un control espaciotemporal sobre la inactivación génica. Para ello, los ARN pequeños condicionales (ARNcc) interactúan y cambian de conformación para transducir entre la unión del ARNm objetivo de detección X y la producción de un sustrato de Dicer que se dirige al ARNm objetivo de silenciamiento independiente Y. Imagen de Hochrein et al. 2013; [ 1 ] utilizada con permiso de la American Chemical Society.

Elementos de diseño

Los scRNA pueden diseñarse para explotar diversos elementos de diseño: [ 1 ]

  • Los reactivos de scRNA pueden ser metaestables o estables.
  • Las cascadas de transducción de señales de scRNA pueden ser catalíticas o no catalíticas.
  • Los scRNA pueden nuclearse entre sí o con moléculas de entrada o salida mediante nucleación de anclaje/anclaje, nucleación de bucle/anclaje o nucleación de plantilla/anclaje.
  • Los scRNA pueden disociarse entre sí o con moléculas de entrada o salida mediante migración de ramificación de 3 vías, migración de ramificación de 4 vías o disociación espontánea.
  • Los reactivos de scRNA pueden ser monómeros, dímeros u otros multímeros.

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 7 Hochrein LM, Schwarzkopf M, Shahgholi M, Yin P, Pierce NA (2013). "Formación de sustratos de Dicer condicionales mediante transducción de forma y secuencia con pequeños ARN condicionales" . Journal of the American Chemical Society . 135 (46): 17322– 17330. Bibcode : 2013JAChS.13517322H . doi : 10.1021/ja404676x . PMC 3842090. PMID 24219616 .  
  2. 1 2 3 4 5 6 Choi HM, Chang JY, Trinh LA, Padilla JE, Fraser SE, Pierce NA (2010). " Amplificación in situ programable para imágenes multiplexadas de expresión de ARNm" . Nature Biotechnology . 28 (11): 1208– 1212. doi : 10.1038/nbt.1692 . PMC 3058322. PMID 21037591 .  
  3. 1 2 Sternberg JB, Pierce NA (2014). "Exquisite sequence selectivity with small conditional RNAs" . Nano Letters . 14 (8): 4568– 4572. Bibcode : 2014NanoL..14.4568S . doi : 10.1021/nl501593r . PMC 4134187. PMID 24979041 .