secuenciación de ARNsn

La secuenciación de ARN de núcleo único (snRNA-seq) , también conocida como secuenciación de ARN de núcleo único o sNuc-seq , es un método de secuenciación de ARN para analizar la expresión génica en células difíciles de aislar, como las de tejidos archivados o difíciles de disociar. Es una alternativa a la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) , ya que analiza núcleos en lugar de células intactas.

La secuenciación de ARNsn (snRNA-seq) minimiza la aparición de expresión génica espuria, ya que la localización de los ribosomas completamente maduros en el citoplasma implica que los ARNm de los factores de transcripción que se expresan después del proceso de disociación no pueden traducirse y, por lo tanto, sus dianas posteriores no pueden transcribirse. ^{[ 1 ]} Además, la tecnología snRNA-seq permite el descubrimiento de nuevos tipos celulares que, de otro modo, serían difíciles de aislar.

El método básico de snRNA-seq requiere cuatro pasos principales: procesamiento de tejido, aislamiento de núcleos, clasificación celular y secuenciación. Para aislar y secuenciar el ARN dentro del núcleo, snRNA-seq utiliza un protocolo de disociación nuclear rápido y suave. Este protocolo permite minimizar los problemas técnicos que pueden afectar a los estudios, especialmente a aquellos relacionados con el comportamiento de los genes de respuesta temprana inmediata (IEG) .

Las células disociadas resultantes se suspenden y la suspensión se lisa suavemente, lo que permite separar los núcleos celulares de sus lisados ​​citoplasmáticos mediante centrifugación . ^{[ 2 ]} Estos núcleos/células separados se clasifican mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en pocillos individuales y se amplifican mediante maquinaria microfluídica . ^{[ 2 ]} La secuenciación se realiza de forma normal y los datos se pueden analizar según corresponda a su uso. Esta metodología básica de snRNA-seq es capaz de perfilar el ARN de tejidos que se conservan o no se pueden disociar, pero no tiene una alta capacidad de rendimiento debido a su dependencia de la clasificación de núcleos por FACS. ^{[ 3 ]} Esta técnica no se puede escalar fácilmente para perfilar grandes cantidades de núcleos o muestras. Existen métodos de scRNA-seq masivamente paralelos que se pueden escalar fácilmente, pero su requisito de una suspensión de células individuales como entrada no es ideal y elimina parte de la flexibilidad disponible con el método snRNA-seq con respecto a los tipos de tejidos y células que se pueden examinar. ^{[ 3 ]} En respuesta, el método DroNc-Seq de snRNA-seq masivamente paralelo con tecnología de gotas fue desarrollado por investigadores del Broad Institute del MIT y Harvard. ^{[ 3 ]} En esta técnica, los núcleos que han sido aislados de su tejido fijado o congelado se encapsulan en gotas con perlas con códigos de barras únicos que están recubiertas con oligonucleótidos que contienen un tramo de desoxitimina (dT) terminal 30. ^{[ 4 ]} Este recubrimiento captura el contenido de ARNm poliadenilado producido cuando los núcleos se lisan dentro de las gotas. ^{[ 4 ]} El ARNm capturado se transcribe inversamente a ADNc después de la ruptura de la emulsión. ^{[ 4 ]} La secuenciación de este ADNc produce los transcriptomas de todos los núcleos individuales que se están analizando y estos pueden utilizarse para muchos propósitos, incluida la identificación de tipos celulares únicos. ^{[ 5 ]}

Las herramientas y equipos de secuenciación utilizados en scRNA-seq pueden emplearse, con modificaciones, para experimentos de snRNA-seq. Illumina describe un flujo de trabajo para el método básico de snRNA-seq que puede realizarse con el equipo existente. ^{[ 2 ]} DroNc-Seq puede llevarse a cabo con plataformas microfluídicas diseñadas para el método Drop-seq scRNA-seq. Sin embargo, Dolomite Bio ha adaptado uno de sus instrumentos, la plataforma automatizada Nadia para scRNA-seq, para su uso nativo también en DroNc-Seq. ^{[ 5 ]} Este instrumento podría simplificar la generación de bibliotecas de secuenciación de núcleos individuales, ya que se utiliza para su propósito original.

En cuanto al análisis de datos después de la secuenciación, el Laboratorio McCarroll de Harvard desarrolló una herramienta computacional conocida como dropSeqPipe. ^{[ 6 ]} Si bien esta herramienta se desarrolló originalmente para su uso con datos de scRNA-seq de Drop-seq, también puede utilizarse con datos de DroNc-Seq, ya que también emplea tecnología de gotas.

La secuenciación de ARN pequeño (snRNA-seq) utiliza núcleos aislados en lugar de células completas para perfilar la expresión génica. Es decir, la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) mide tanto los transcritos citoplasmáticos como los nucleares, mientras que la snRNA-seq mide principalmente los transcritos nucleares (aunque algunos transcritos pueden estar unidos al retículo endoplasmático rugoso y parcialmente conservados en preparaciones nucleares). ^{[ 7 ]} Esto permite que la snRNA-seq procese solo el núcleo y no la célula completa. Por esta razón, en comparación con la scRNA-seq, la snRNA-seq es más apropiada para perfilar la expresión génica en células difíciles de aislar (por ejemplo, adipocitos, neuronas), así como en tejidos conservados. ^{[ 5 ]}

Además, los núcleos necesarios para la secuenciación de ARN pequeño (snRNA-seq) se pueden obtener de forma rápida y sencilla a partir de tejidos frescos, ligeramente fijados o congelados, mientras que el aislamiento de células individuales para la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) requiere incubaciones y procesamiento prolongados. Esto permite a los investigadores obtener transcriptomas que no se ven tan afectados durante el proceso de aislamiento.

En neurociencia, las neuronas tienen una naturaleza interconectada que hace extremadamente difícil aislar neuronas individuales intactas. ^{[ 8 ]} A medida que snRNA-seq ha surgido como un método alternativo para evaluar el transcriptoma de una célula a través del aislamiento de núcleos individuales, ha sido posible realizar estudios de neuronas individuales a partir de tejido cerebral humano post mortem . ^{[ 9 ]} snRNA-seq también ha permitido el primer análisis de neuronas individuales de la expresión de genes tempranos inmediatos (IEG) asociados con la formación de la memoria en el hipocampo del ratón . ^{[ 1 ]} En 2019, Dmitry et al. utilizaron el método en tejido cortical de pacientes con TEA (Trastorno del Espectro Autista) para identificar cambios transcriptómicos asociados con el TEA en tipos celulares específicos, lo que constituye la primera evaluación del transcriptoma específica de un tipo celular en cerebros afectados por el TEA. ^{[ 10 ]}

Fuera de la neurociencia, snRNA-seq también se ha utilizado en otras áreas de investigación. En 2019, Haojia et al compararon scRNA-seq y snRNA-seq en un estudio genómico alrededor del riñón. Encontraron que snRNA-seq logra una tasa de detección de genes equivalente a la de scRNA-seq en riñón adulto con varias ventajas significativas (incluida la compatibilidad con muestras congeladas, el sesgo de disociación reducido, etc.). ^{[ 11 ]} En 2019, Joshi et al utilizaron snRNA-seq en un estudio de biología pulmonar humana en el que encontraron que snRNA-seq permitió la identificación imparcial de tipos de células a partir de tejidos pulmonares sanos y fibróticos congelados. ^{[ 12 ]} El tejido cardíaco de mamíferos adultos puede ser extremadamente difícil de disociar sin dañar las células, lo que no permite una secuenciación fácil del tejido. Sin embargo, en 2020, científicos alemanes presentaron el primer informe de secuenciación de un corazón de mamífero adulto utilizando snRNA-seq y pudieron proporcionar distribuciones prácticas de tipos de células dentro del corazón ^{[ 13 ].}