prueba de locus específico

La prueba de locus específico (SLT, por sus siglas en inglés) es una prueba genética para evaluar el impacto de mutágenos como la radiación o los productos químicos en las tasas de mutación de un conjunto seleccionado de genes fácilmente medibles. La SLT mide las tasas de mutación en un ratón de laboratorio mediante el apareamiento de animales de tipo silvestre expuestos al mutágeno con ratones de la cepa de prueba que portan alelos recesivos en un conjunto definido de loci marcadores, clásicamente siete, con rasgos visibles como color de pelaje alterado u orejas cortas. ^{[ 1 ]}

La prueba de locus específico es un ensayo que utiliza la mutagénesis de la línea germinal del ratón para detectar y cuantificar mutaciones hereditarias ; estas mutaciones son las que se transmiten a la descendencia de primera generación y se miden como rasgos visibles. ^{[ 2 ]} Debido a que los genes marcadores son un número pequeño de loci (siete, en los ratones más utilizados), el ensayo recibió el nombre de "prueba de locus específico del ratón" o "SLT". ^{[ 3 ]} El método se desarrolló para el tratamiento y los efectos de la radiación, pero el mismo enfoque se aplicó posteriormente a la mutagénesis química. ^{[ 2 ] [ 4 ]}

El ensayo se utiliza mejor para medir mutaciones puntuales hereditarias y pequeñas deficiencias que afectan al alelo de tipo silvestre aportado por el progenitor tratado, las cuales se revelan cuando se emparejan con un alelo marcador recesivo en la descendencia. ^{[ 2 ]}

En la descendencia del cruce, una mutación inducida recientemente en uno de los loci marcadores produce el rasgo recesivo (y visible); esto permite una detección rápida y a gran escala de mutaciones inducidas por radiación y sustancias químicas, y no requiere equipo especializado. ^{[ 4 ]}

Para realizar la prueba, se debe producir un individuo heterocigoto para múltiples alelos, cada uno con un fenotipo visible distinto en su estado homocigoto recesivo. Por lo tanto, un progenitor de tipo silvestre, ya sea sin tratamiento como control o expuesto al mutágeno que se está probando, se cruza con una cepa de prueba recesiva múltiple. ^{[ 2 ] [ 3 ]} La cepa estándar de marcadores visibles "T" tiene un conjunto de los siguientes siete marcadores recesivos: ^{[ 2 ] [ 3 ]}

• a / no agutí - para variación de color de pelaje
• b / abrigo marrón
• c o cch / albino o locus relacionado con la chinchilla
• p / dilución de ojos rosados
• d / diluido (dispersión de pigmento de recubrimiento)
• se / oreja corta (el gen BMP5 )
• pelaje pío o manchado

La mayoría de los marcadores utilizados en la prueba son visibles a través del color del pelaje, el color de los ojos o la morfología de las orejas. ^{[ 2 ] [ 3 ]} La descendencia heterocigota del cruce normalmente tiene una apariencia de tipo silvestre a menos que haya ocurrido una nueva mutación en uno de los loci marcados. ^{[ 4 ]} Sin embargo, un aspecto clave de la prueba es que la descendencia mutante se reconoce por el fenotipo recesivo visible en uno de los loci marcadores. ^{[ 4 ]} La evaluación del impacto del tratamiento es posible aproximadamente a las tres semanas, aunque algunos mutantes son reconocibles antes en el desarrollo. ^{[ 2 ]} Las pruebas de alelismo se utilizan para confirmar mutaciones sospechadas cuando sea necesario. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

Se sabe que los tipos de mutaciones que producen un fenotipo visible son cambios intragénicos, incluyendo sustituciones de pares de bases, cambios de marco de lectura y deleciones intragénicas, además de pequeñas deficiencias que afectan a loci marcados y reordenamientos macroscópicos ocasionales. ^{[ 2 ]} Algunas mutaciones visibles dominantes fuera de los loci marcados son detectables incidentalmente. ^{[ 3 ] [ 2 ]} Los mutantes dobles en loci estrechamente ligados, especialmente d y se , a veces indican deleciones más grandes. ^{[ 2 ] [ 3 ]} El espectro mutacional medido a través del conjunto de loci marcadores se utiliza para comparar las diferencias cualitativas entre mutágenos. ^{[ 2 ]}

La aplicación original del método fue evaluar las respuestas a la dosis de mutagénesis por radiación en células germinales de ratón, ya que las mutaciones que se heredan ocurren en células madre espermatogoniales, etapas post-espermatogoniales u ovocitos. ^{[ 2 ] [ 1 ] [ 4 ]} Esto proporcionó una comparación con las evaluaciones de la tasa de mutación de Drosophila . ^{[ 4 ]} La prueba de locus específico fue utilizada por primera vez para medir el efecto de la mutagénesis química por Bruce Cattanach en su trabajo con trietilenomelamina (TEM). ^{[ 5 ]} Trabajos posteriores a mayor escala analizaron más de 25 agentes químicos, y de estos, 17 dieron clasificaciones positivas o negativas. ^{[ 2 ] [ 4 ]} Un experimento a pequeña escala con ENU fue suficiente para mostrar una fuerte mutagenicidad en espermatogonias de ratón; como resultado, el ENU se utilizó posteriormente ampliamente como mutágeno de ratón, ya que crea principalmente mutaciones en genes individuales en lugar de aberraciones cromosómicas a gran escala. ^{[ 4 ]}

Un hallazgo importante del análisis de la tasa de dosis realizado con mutagénesis por radiación es que la exposición prolongada produjo menos mutaciones que la exposición aguda a la misma dosis total; esto proporcionó evidencia temprana de la reparación del daño mutacional. ^{[ 4 ]} Un artículo clave de 1958 probó si la frecuencia de mutación inducida por radiación dependía de la tasa de dosis. ^{[ 6 ]} Los autores encontraron tasas de mutación de locus específicos más bajas después de la irradiación gamma crónica de espermatogonias que después de la exposición aguda a rayos X. ^{[ 6 ]} Estas observaciones desafiaron la visión anterior, basada en gran medida en espermatozoides de Drosophila , de que la frecuencia de mutación era independiente de la tasa de dosis. ^{[ 6 ]} Sus hallazgos sugirieron que los riesgos genéticos bajo algunas condiciones de radiación podrían ser menores que las estimaciones basadas solo en experimentos de irradiación aguda. ^{[ 6 ]}

Las ventajas de la SLT son que proporciona un ensayo directo del daño genético transmitido en un mamífero; hay una puntuación de primera generación a través de fenotipos visibles simples que no requieren instrumentación especializada para la versión clásica de marcadores visibles. ^{[ 4 ] [ 2 ] [ 3 ]} Los mutantes se pueden recuperar como cepas para análisis genéticos adicionales. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Y la prueba es útil para comparar espectros mutacionales entre loci. ^{[ 2 ]}

Las limitaciones de la prueba son que se requiere un gran número de ratones y solo se monitorea un pequeño conjunto de loci. ^{[ 3 ]} El gran número de ratones requiere mucho espacio y la cría de los animales lleva mucho tiempo. ^{[ 3 ] [ 2 ]} Además, las mutaciones sin efectos visibles en los loci analizados (como las mutaciones silenciosas ) no se detectarán, lo que resulta en un recuento subestimado de eventos mutacionales. ^{[ 3 ]}

El SLT fue desarrollado independientemente por Toby C. Carter en Edimburgo y William Russell en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge . ^{[ 3 ] [ 7 ]}

Russell comenzó a desarrollar el método en 1947 después de unirse al Laboratorio Nacional de Oak Ridge, y en las primeras etapas de planificación participaron Alexander Hollaender , Sewall Wright y HJ Muller . ^{[ 4 ]} La motivación para el desarrollo del SLT fue la necesidad de datos de mamíferos sobre mutaciones genéticas inducidas por radiación, porque en ese momento, las estimaciones de riesgo dependían en gran medida de datos de Drosophila y no de un animal vertebrado más emparentado con los humanos. ^{[ 4 ]}

El primer experimento de irradiación de Oak Ridge se realizó en marzo de 1949, mientras que el primer mutante piloto confirmado fue en el locus d y el segundo mutante piloto fue en el locus c . ^{[ 4 ]} En un informe del Simposio de Cold Spring Harbor de 1951, el experimento principal de rayos X de 600 R realizado por Russell utilizó 48.007 descendientes e identificó 53 mutaciones de locus específico, mientras que el grupo de control con 37.868 descendientes identificó solo dos mutaciones, lo que demuestra que el método tiene alta sensibilidad para la detección de mutaciones inducidas por radiación. ^{[ 4 ] [ 1 ]}