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Articulo de referencia

Cuantificación de ácidos nucleicos

Densidad óptica de la muestra de ribosoma. Se indican las longitudes de onda importantes de 260 nm y 280 nm. En biología molecular , la cuantificación de ácidos nucleicos se rea...

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Densidad óptica de la muestra de ribosoma. Se indican las longitudes de onda importantes de 260 nm y 280 nm.

En biología molecular , la cuantificación de ácidos nucleicos se realiza habitualmente para determinar las concentraciones promedio de ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Las reacciones que utilizan ácidos nucleicos suelen requerir cantidades y pureza específicas para un rendimiento óptimo. Hasta la fecha, existen dos métodos principales que utilizan los científicos para cuantificar, o establecer la concentración, de ácidos nucleicos (como ADN o ARN) en una solución: la cuantificación espectrofotométrica y el marcaje por fluorescencia UV en presencia de un colorante de ADN.

Análisis espectrofotométrico

Una de las prácticas más utilizadas para cuantificar ADN o ARN es el análisis espectrofotométrico mediante un espectrofotómetro . [ 1 ] Un espectrofotómetro permite determinar las concentraciones promedio de los ácidos nucleicos ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza.

El análisis espectrofotométrico se basa en el principio de que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta siguiendo un patrón específico. En el caso del ADN y el ARN, una muestra se expone a luz ultravioleta con una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un fotodetector mide la luz que la atraviesa. Parte de la luz ultravioleta la atraviesa y otra parte es absorbida por el ADN/ARN. Cuanta más luz absorbe la muestra, mayor es la concentración de ácido nucleico en ella. Como resultado, llega menos luz al fotodetector , lo que produce una mayor densidad óptica (DO).

Utilizando la ley de Beer-Lambert, es posible relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. A una longitud de onda de 260  nm, el coeficiente de extinción promedio para el ADN de doble cadena (dsDNA) es 0,020 (μg/mL) −1 cm −1 , para el ADN de cadena simple (ssDNA) es 0,027 (μg/mL) −1 cm −1 , para el ARN de cadena simple (ssRNA) es 0,025 (μg/mL) −1 cm −1 y para oligonucleótidos cortos de cadena simple depende de la longitud y la composición de bases. Por lo tanto, una absorbancia (A) de 1 corresponde a una concentración de 50 μg/mL para el ADN de doble cadena. Este método de cálculo es válido hasta un A de al menos 2. [ 2 ] Puede ser necesario un coeficiente de extinción más preciso para los oligonucleótidos; estos pueden predecirse utilizando el modelo del vecino más cercano . [ 3 ]

Cálculos

La densidad óptica (DO) [ 4 ] se genera a partir de la ecuación:

Densidad óptica = Log (Intensidad de la luz incidente / Intensidad de la luz transmitida)

En términos prácticos, una muestra que no contiene ADN ni ARN no debería absorber nada de la luz ultravioleta y, por lo tanto, producir una DO de 0.

Densidad óptica = Log (100/100) = 0

Al utilizar el análisis espectrofotométrico para determinar la concentración de ADN o ARN, se emplea la ley de Beer-Lambert para determinar concentraciones desconocidas sin necesidad de curvas de calibración. En esencia, la ley de Beer-Lambert permite relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. Los siguientes factores de conversión de unidades de absorbancia a concentración de ácido nucleico se utilizan para convertir la DO a concentración de muestras de ácido nucleico desconocidas: [ 5 ]

A260 dsDNA = 50  μg/mL
A260 ssDNA = 33  μg/mL
ARN monocatenario A260 = 40  μg/mL

Factores de conversión

Al usar una longitud de trayectoria  de 10 mm , simplemente multiplique la DO por el factor de conversión para determinar la concentración. Por ejemplo, una muestra de ADN bicatenario con una DO de 2,0 corresponde a una muestra con una concentración de 100 μg/mL. 

Cuando se utiliza una longitud de trayectoria menor a 10 mm, la DO resultante se reduce en un factor de 10/longitud de trayectoria. Siguiendo el ejemplo anterior con una  longitud de trayectoria de 3 mm, la DO para la  muestra de 100 μg/mL se reduciría a 0,6. Para normalizar la concentración a un equivalente de 10 mm, se procede de la siguiente manera:

0,6 DO X (10/3) * 50  μg/mL = 100  μg/mL

La mayoría de los espectrofotómetros permiten seleccionar el tipo de ácido nucleico y la longitud del recorrido óptico, de modo que la concentración resultante se normaliza a una  longitud de recorrido de 10 mm, basándose en los principios de la ley de Beer .

A260 como medida de cantidad

La "unidad A260" se utiliza como medida de cantidad para los ácidos nucleicos. Una unidad A260 es la cantidad de ácido nucleico contenida en 1 mL que produce una DO de 1. Se aplican los mismos factores de conversión y, por lo tanto, en estos contextos:

1 unidad A260 de ADN bicatenario = 50  μg
1 unidad A260 de ssDNA = 33  μg
1 unidad A260 de ARN monocatenario = 40  μg

Pureza de la muestra (proporciones 260:280 / 260:230)

Es común que las muestras de ácidos nucleicos estén contaminadas con otras moléculas (es decir, proteínas, compuestos orgánicos, etc.). El beneficio secundario de utilizar el análisis espectrofotométrico para la cuantificación de ácidos nucleicos es la capacidad de determinar la pureza de la muestra utilizando el cálculo de 260  nm:280  nm. La relación de la absorbancia a 260 y 280  nm (A 260/280 ) se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para el ADN puro, A 260/280 se considera generalmente ~1,8, pero se ha argumentado que se traduce —debido a errores numéricos en el artículo original de Warburg— en una mezcla de 60 % de proteína y 40 % de ADN. [ 6 ] La relación para el ARN puro A 260/280 es ~2,0. Estas relaciones se utilizan comúnmente para evaluar la cantidad de contaminación proteica que queda del proceso de aislamiento de ácidos nucleicos, ya que las proteínas absorben a 280  nm.

La relación de absorbancia a 260  nm frente a 280  nm se utiliza comúnmente para evaluar la contaminación por ADN en soluciones proteicas , dado que las proteínas (en particular, los aminoácidos aromáticos) absorben luz a 280  nm. [ 2 ] [ 7 ] Sin embargo, lo contrario no es cierto: se requiere una cantidad relativamente grande de contaminación proteica para afectar significativamente la relación 260:280 en una solución de ácido nucleico. [ 2 ] [ 6 ]

La proporción 260:280 tiene una alta sensibilidad para la contaminación por ácidos nucleicos en proteínas:

La relación 260:280 carece de sensibilidad para la contaminación de proteínas en los ácidos nucleicos (tabla mostrada para ARN, el 100% de ADN es aproximadamente 1,8):

Esta diferencia se debe al coeficiente de atenuación másica mucho mayor que presentan los ácidos nucleicos a 260  nm y 280  nm, en comparación con el de las proteínas. Por ello, incluso para concentraciones relativamente altas de proteína, esta contribuye relativamente poco a la absorbancia a 260 y 280 nm. Si bien la contaminación proteica no puede evaluarse de forma fiable mediante una relación 260:280, esto también significa que introduce poco error en la estimación de la cantidad de ADN.

Identificación de la contaminación

El análisis de los espectros de las muestras puede resultar útil para identificar si existe algún problema con la pureza de la muestra.

Otros contaminantes comunes

  • La contaminación por fenol , comúnmente utilizado en la purificación de ácidos nucleicos, puede alterar significativamente las estimaciones de cuantificación. El fenol absorbe con un pico a 270  nm y una absorbancia A 260/280 de 1,2. Las preparaciones de ácidos nucleicos no contaminadas con fenol deberían tener una absorbancia A 260/280 de alrededor de 2. [ 2 ] La contaminación por fenol puede contribuir significativamente a la sobreestimación de la concentración de ADN.
  • La absorción a 230  nm puede deberse a la contaminación por iones fenolato , tiocianatos y otros compuestos orgánicos. Para una muestra de ARN puro, la relación A 230:260:280 debería ser de aproximadamente 1:2:1, y para una muestra de ADN puro, la relación A 230:260:280 debería ser de aproximadamente 1:1,8:1. [ 9 ]
  • La absorción a 330  nm o superior indica la presencia de partículas que contaminan la solución, lo que provoca la dispersión de la luz en el rango visible. En una muestra de ácido nucleico puro, este valor debería ser cero.
  • Podrían obtenerse valores negativos si se utilizara una solución incorrecta como blanco. Alternativamente, estos valores podrían deberse a la fluorescencia de un colorante presente en la solución.

Análisis mediante marcaje con colorantes fluorescentes

Un método alternativo para evaluar la concentración de ADN y ARN consiste en marcar la muestra con un marcador fluorescente , que es un colorante fluorescente utilizado para medir la intensidad de los colorantes que se unen a los ácidos nucleicos y fluorescen selectivamente al unirse (por ejemplo , bromuro de etidio ). Este método es útil cuando la concentración es demasiado baja para evaluarla con precisión mediante espectrofotometría y cuando los contaminantes que absorben a 260  nm imposibilitan una cuantificación precisa mediante dicho método. La ventaja de la cuantificación por fluorescencia de ADN y ARN radica en su mayor sensibilidad en comparación con el análisis espectrofotométrico . Sin embargo, este aumento de sensibilidad conlleva un mayor costo por muestra y un proceso de preparación de la muestra más prolongado .

Existen dos métodos principales para abordar esto. El método de "detección por puntos" consiste en colocar una muestra directamente sobre un gel de agarosa o una película plástica . El colorante fluorescente está presente en el gel de agarosa o se añade en concentraciones adecuadas a las muestras sobre la película plástica. Se colocan muestras de concentración conocida junto a la muestra. La concentración de la muestra desconocida se estima comparando su fluorescencia con la de estas muestras de concentración conocida. Alternativamente, se puede hacer pasar la muestra a través de un gel de agarosa o poliacrilamida , junto con algunas muestras de concentración conocida. Al igual que en la prueba de detección por puntos, la concentración se estima comparando la intensidad de fluorescencia con la de las muestras conocidas. [ 2 ]

Si los volúmenes de muestra son lo suficientemente grandes como para usar microplacas o cubetas , las muestras cargadas con colorante también se pueden cuantificar con un fotómetro de fluorescencia . El volumen mínimo de muestra comienza en 0,3 μL. [ 10 ]

Hasta la fecha no existe ningún método de fluorescencia para determinar la contaminación proteica de una muestra de ADN que sea similar a la versión espectrofotométrica de 260  nm/280 nm. 

Véase también

Referencias

  1. ↑ Huss, Volker AR; Festl, Herbert; Schleifer, Karl Heinz (1983). "Estudios sobre la determinación espectrofotométrica de la hibridación del ADN a partir de las tasas de renaturalización". Systematic and Applied Microbiology . 4 (2): 184– 192. doi : 10.1016/S0723-2020(83)80048-4 . ISSN 0723-2020 . PMID 23194591 .  
  2. 1 2 3 4 5 Sambrook y Russell (2001). Clonación molecular: Manual de laboratorio (3.ª ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press . ISBN  978-0-87969-577-4.
  3. ↑ Tataurov AV; You Y.; Owczarzy R. (2008). "Predicción del espectro ultravioleta de ácidos desoxirribonucleicos monocatenarios y bicatenarios". Biophys. Chem . 133 ( 1– 3): 66– 70. doi : 10.1016/j.bpc.2007.12.004 . PMID 18201813 . 
  4. ↑ IUPAC, Compendio de Terminología Química . Edición en línea: "absorbancia".
  5. ↑ "Cuantificación de ADN por absorbancia UV" . BMG LABTECH . Consultado el 17 de marzo de 2024 .
  6. 1 2 Glasel J. (1995). "Validez de la pureza de los ácidos nucleicos monitorizada mediante las relaciones de absorbancia 260/280". BioTechniques . 18 (1): 62– 63. PMID 7702855 . )
  7. ^ (Sambrook y Russell citan el artículo original: Warburg, O. & Christian W. (1942). "Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase". Biochem. Z. 310 : 384– 421 .)
  8. ↑ "Evaluación de la pureza de los ácidos nucleicos" (PDF) . Thermo Scientific . Consultado el 28 de septiembre de 2016 .
  9. ↑ "Análisis de ADN o ARN mediante sus longitudes de onda: 230 nm, 260 nm, 280 nm" . Bioteachnology.com. 13 de enero de 2010. Archivado del original el 4 de marzo de 2012. Consultado el 12 de marzo de 2010 .
  10. ↑ Precisión y reproducibilidad en la cuantificación de ácidos nucleicos