Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Controles de pico

Los controles de adición o "spike-ins" son cantidades conocidas de moléculas —como secuencias de oligonucleótidos (ARN, ADN), proteínas o metabolitos— que se añaden a una muestr...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

Los controles de adición o "spike-ins" son cantidades conocidas de moléculas —como secuencias de oligonucleótidos (ARN, ADN), proteínas o metabolitos— que se añaden a una muestra biológica para una estimación cuantitativa más precisa de la molécula de interés en diferentes muestras y lotes. [ 1 ] Los "spike-ins" se utilizan especialmente en ensayos de secuenciación de alto rendimiento , [ 2 ] donde actúan como referencia interna para monitorizar y normalizar los sesgos técnicos y biológicos introducidos durante el procesamiento de la muestra, como la preparación de la biblioteca , la manipulación y la medición. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]

Los marcadores de interés (spike-ins) pueden corregir sesgos técnicos específicos y permiten una estimación precisa de las moléculas endógenas de interés, lo que resulta en una mejor calidad de los datos y una estandarización entre diferentes muestras o experimentos. Los marcadores de interés pueden ser sintéticos o exógenos (no forman parte originalmente de la muestra). En los ensayos basados ​​en secuenciación, el material exógeno generalmente se deriva del genoma de una especie diferente, como Drosophila melanogaster o Arabidopsis thaliana . [ 6 ]

Diseño

Los spike-ins están sujetos a los mismos pasos experimentales y posibles sesgos que las moléculas nativas dentro de una muestra después de haber sido agregados. Se agregan temprano en el flujo de trabajo experimental, a menudo durante o inmediatamente después de la lisis o extracción de la muestra y antes de la secuenciación. [ 7 ] Por lo tanto, la idoneidad de los spike-ins, su diseño y análisis posterior deben permitir tener en cuenta tantas fuentes de variación experimental como sea posible. Idealmente, los spike-ins se asemejan mucho al material de entrada que contiene epítopos de interés pero permiten una clara diferenciación de las moléculas nativas. [ 1 ] Dado que la cantidad inicial de cada molécula de spike-in es conocida, su cantidad medida al final del experimento refleja los efectos acumulativos de factores técnicos, tales como eficiencia de extracción, eficiencias de reacción enzimática (p. ej., transcripción inversa , ligación , amplificación ), pérdida de muestra y sensibilidad de medición.

En los ensayos de secuenciación, los marcadores de referencia se pueden combinar además con identificadores moleculares únicos para aumentar la sensibilidad y la especificidad . [ 8 ] [ 9 ]

Análisis

La información obtenida mediante los controles de referencia (spike-in) se suele aprovechar tras realizar los análisis bioinformáticos iniciales, cuyo resultado final son los recuentos absolutos de los diferentes controles de referencia para cada biblioteca. Posteriormente, diversos métodos de normalización o calibración de los controles de referencia utilizan esta información como línea base para ajustar la señal principal de interés.

Normalización de picos

La elección de un método de normalización puede influir significativamente en las conclusiones posteriores a la normalización extraídas de un experimento. [ 10 ] El primer método de normalización de spike-in, conocido como lecturas ajustadas a la referencia por millón (RRPM), utilizó un factor de escala determinado a partir del número de lecturas alineadas al genoma exógeno. [ 5 ] Métodos posteriores modificaron RRPM para considerar los recuentos de lecturas spike-in derivadas de la muestra de entrada. [ 11 ] Un enfoque común implica determinar la proporción entre los recuentos de lecturas spike-in observados y los recuentos esperados, o simplemente calcular el total de lecturas spike-in por muestra. Estos valores se utilizan luego para derivar factores de escala específicos de la muestra. Por ejemplo, si una muestra produce menos lecturas spike-in de lo esperado o menos que otra muestra normalizada a la misma entrada, sus recuentos de genes endógenos se escalan hacia arriba, bajo el supuesto de que la menor recuperación spike-in refleja una pérdida técnica global para esa muestra.

Los métodos más sofisticados pueden utilizar análisis de regresión [ 12 ] o análisis factorial [ 13 ] en múltiples aditivos añadidos en diversas concentraciones para modelar la relación entre la cantidad de entrada y la salida de secuenciación, con el objetivo de obtener una estimación más robusta del sesgo técnico.

Aplicaciones

En función de la aplicación, se utilizan varios tipos de controles de pico:

Otros marcadores menos utilizados pueden incluir péptidos o metabolitos. En proteómica y metabolómica , a menudo se añaden péptidos sintéticos marcados con isótopos estables (por ejemplo, péptidos AQUA) o metabolitos, proteínas purificadas o metabolitos endógenos o moléculas pequeñas no endógenas en cantidades conocidas para su cuantificación y normalización. [ 16 ] [ 17 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Wong, Ted; Deveson, Ira W; Hardwick, Simon A; Mercer, Tim R (2017-06-01). Berger, Bonnie (ed.). "ANAQUIN: un conjunto de herramientas de software para el análisis de controles de pico para secuenciación de próxima generación" . Bioinformatics . 33 (11): 1723– 1724. doi : 10.1093/bioinformatics/btx038 . ISSN 1367-4803 . PMID 28130232 .  
  2. 1 2 Chen, Kaifu; Hu, Zheng; Xia, Zheng; Zhao, Dongyu; Li, Wei; Tyler, Jessica K. (2016-03-01). "El hecho pasado por alto: necesidad fundamental de control de Spike-In para prácticamente todos los análisis de todo el genoma" . Biología molecular y celular . 36 (5): 662– 667. doi : 10.1128/mcb.00970-14 . ISSN 1098-5549 . PMC 4760223. PMID 26711261 .   
  3. 1 2 Jiang, L; Schlesinger, F; Davis, CA; Zhang, Y; Li, R; Salit, M; Gingeras, TR; Oliver, B (septiembre de 2011). "Estándares sintéticos de control para experimentos de secuenciación de ARN" . Genome Research . 21 (9): 1543– 1551. doi : 10.1101/gr.121095.111 . PMC 3166838. PMID 21816910 .  
  4. 1 2 Jiang, Lichun; Schlesinger, Felix; Davis, Carrie A.; Zhang, Yu; Li, Renhua; Salit, Marc; Gingeras, Thomas R.; Oliver, Brian (2011-08-04). "Estándares sintéticos de control para experimentos de secuenciación de ARN" . Genome Research . 21 (9): 1543– 1551. doi : 10.1101/gr.121095.111 . ISSN 1088-9051 . PMC 3166838. PMID 21816910 .   
  5. 1 2 3 4 Orlando, David A; Chen, Mei Wei; Brown, Victoria E; Solanki, Snehakumari; Choi, Yoon J; Olson, Eric R.; Fritz, Christian C.; Bradner, James E.; Guenther, Matthew G. (2014). "La normalización cuantitativa de ChIP-Seq revela una modulación global del epigenoma" . Cell Reports . 9 (3): 1163– 1170. doi : 10.1016/j.celrep.2014.10.018 . ISSN 2211-1247 . PMID 25437568 .  
  6. ↑ Shen, Shu Yi; Burgener, Justin M.; Bratman, Scott V.; De Carvalho, Daniel D. (30 de agosto de 2019). "Preparación de bibliotecas cfMeDIP-seq para el perfilado del metiloma del ADN libre de células plasmáticas". Nature Protocols . 14 (10): 2749– 2780. doi : 10.1038/s41596-019-0202-2 . ISSN 1754-2189 . PMID 31471598 .  
  7. 1 2 Baker, SC; Petrov, SR; Riley, DR; Dafforn, A; Salit, ML (noviembre de 2005). "El Consorcio de Controles Externos de ARN: un informe de progreso". Nature Methods . 2 (10): 731– 734. doi : 10.1038/nmeth1005-731 . PMID 16200073 . 
  8. ^ Kivioja, Teemu; Vähärautio, Anna; Karlsson, Kasper; Bonke, Martín; Enge, Martín; Linnarsson, Sten; Taipale, Jussi (20 de noviembre de 2011). "Contar números absolutos de moléculas utilizando identificadores moleculares únicos". Métodos de la naturaleza . 9 (1): 72– 74. doi : 10.1038/nmeth.1778 . ISSN 1548-7091 . PMID 22101854 .  
  9. ↑ Lun, Aaron TL; Calero-Nieto, Fernando J.; Haim-Vilmovsky, Liora; Göttgens, Berthold; Marioni, John C. (noviembre de 2017). "Evaluación de la fiabilidad de la normalización con marcadores de referencia para el análisis de datos de secuenciación de ARN de células individuales" . Genome Research . 27 (11): 1795– 1806. doi : 10.1101/gr.222877.117 . ISSN 1549-5469 . PMC 5668938. PMID 29030468 .   
  10. ↑ Patel, Lauren A.; Cao, Yuwei; Mendenhall, Eric M.; Benner, Christopher; Goren, Alon (septiembre de 2024). "El salvaje oeste de la normalización de picos" . Nature Biotechnology . 42 (9): 1343– 1349. doi : 10.1038/s41587-024-02377- y . ISSN 1546-1696 . PMC 12266361. PMID 39271835 .   
  11. ↑ Niu, Kongyan; Liu, Rui; Liu, Nan (2018). "ChIP-seq cuantitativo mediante la adición de un control interno de otra especie" . Bio -Protocol . 8 (16) e2981. doi : 10.21769/bioprotoc.2981 . ISSN 2331-8325 . PMC 8328608. PMID 34395781 .   
  12. ↑ Bolstad, BM; Irizarry, RA; Åstrand, M.; Speed, TP (22 de enero de 2003). "Una comparación de métodos de normalización para datos de matrices de oligonucleótidos de alta densidad basados ​​en la varianza y el sesgo" . Bioinformatics . 19 (2): 185– 193. doi : 10.1093/bioinformatics/19.2.185 . ISSN 1367-4811 . PMID 12538238 .  
  13. ↑ Risso, Davide; Ngai, John; Speed, Terence P.; Dudoit, Sandrine (septiembre de 2014). "Normalización de datos de RNA-seq mediante análisis factorial de genes o muestras de control" . Nature Biotechnology . 32 (9): 896–902 . doi : 10.1038/nbt.2931 . ISSN 1546-1696 . PMC 4404308. PMID 25150836 .   
  14. ↑ Deveson, Ira W.; Chen, Wendy Y.; Wong, Ted; Hardwick, Simon A.; Andersen, Stacey B.; Nielsen, Lars K.; Mattick, John S.; Mercer, Tim R. (septiembre de 2016). "Representación de la variación genética con estándares de ADN sintético" . Nature Methods . 13 (9): 784–791 . doi : 10.1038/nmeth.3957 . ISSN 1548-7105 . PMID 27502217 .  
  15. ↑ Egan, Brent; Yuan, Chao-cheng; Craske, Michael; Labhart, Paul; Miller, Christopher; Papin, Candice; Johnson, Dane; Schrader, Marc (26 de marzo de 2012). "Utilización de estándares Spike-in para la normalización y el control de calidad de experimentos ChIP-seq" . BMC Bioinformatics . 13 (9): 3921–3928 . doi : 10.1186/1471-2105-13-54 . PMC 3359226. PMID 22448910 .  
  16. ↑ Kettenbach, Arminja N.; Rush, John; Gerber, Scott A. (febrero de 2011). "Cuantificación absoluta de la abundancia de proteínas y modificaciones postraduccionales con péptidos sintéticos marcados con isótopos estables" . Nature Protocols . 6 (2): 175– 186. doi : 10.1038/nprot.2010.196 . ISSN 1750-2799 . PMC 3736726. PMID 21293459 .   
  17. ↑ Chokkathukalam, Achuthanunni; Kim, Dong-Hyun; Barrett, Michael P.; Breitling, Rainer; Creek, Darren J. (febrero de 2014). " Estudios de marcaje con isótopos estables en metabolómica: nuevas perspectivas sobre la estructura y la dinámica de las redes metabólicas" . Bioanalysis . 6 (4): 511– 524. doi : 10.4155/bio.13.348 . ISSN 1757-6199 . PMC 4048731. PMID 24568354 .