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microscopía STED

La microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED) proporciona mejoras significativas en la resolución con respecto a las que se pueden lograr con la microscopía confoc...

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La microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED) proporciona mejoras significativas en la resolución con respecto a las que se pueden lograr con la microscopía confocal .

La microscopía de agotamiento por emisión estimulada ( STED ) es una de las técnicas que componen la microscopía de superresolución . Crea imágenes de superresolución mediante la desactivación selectiva de fluoróforos , minimizando el área de iluminación en el punto focal y, por lo tanto, mejorando la resolución alcanzable para un sistema dado. [ 1 ] Fue desarrollada por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994, [ 2 ] y fue demostrada experimentalmente por primera vez por Hell y Thomas Klar en 1999. [ 3 ] Hell recibió el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo. En 1986, VA Okhonin [ 4 ] (Instituto de Biofísica, Academia de Ciencias de la URSS , Rama Siberiana, Krasnoyarsk) patentó la idea de STED. [ 5 ] Esta patente era desconocida para Hell y Wichmann en 1994.

La microscopía STED es una de las diversas técnicas de microscopía de superresolución desarrolladas recientemente para superar el límite de difracción de la microscopía óptica y aumentar la resolución. STED es una técnica funcional determinista que aprovecha la respuesta no lineal de los fluoróforos comúnmente utilizados para marcar muestras biológicas, con el fin de mejorar la resolución. Esto significa que STED permite obtener imágenes con resoluciones inferiores al límite de difracción. A diferencia de las técnicas funcionales estocásticas, como la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), estas últimas utilizan modelos matemáticos para reconstruir imágenes con una resolución inferior al límite de difracción a partir de múltiples conjuntos de imágenes con resolución limitada por difracción.

Fondo

La fórmula de Ernst Abbe para el límite de difracción, grabada en piedra en un monumento en Jena .
Diagrama de Jablonski que muestra el corrimiento al rojo del fotón estimulado. Este corrimiento al rojo permite ignorar el fotón estimulado.
Diagrama del diseño de un dispositivo STED. El diseño de doble láser permite utilizar la excitación y la emisión estimulada conjuntamente para la técnica STED.

En la microscopía tradicional, la resolución que se puede obtener está limitada por la difracción de la luz . Ernst Abbe desarrolló una ecuación para describir este límite. La ecuación es:

D=λ2nortepecado⁡α=λ2norteA{\displaystyle \mathrm {D} ={\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }}}={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} }}}

donde D es el límite de difracción, λ es la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica , o el índice de refracción del medio multiplicado por el seno del ángulo de incidencia. n describe el índice de refracción de la muestra, α mide el semiángulo sólido desde el cual la luz es captada por un objetivo, λ es la longitud de onda de la luz utilizada para excitar la muestra y NA es la apertura numérica. Para obtener alta resolución (es decir, valores pequeños de D), las longitudes de onda cortas y los valores altos de NA (NA = n sinα) son óptimos. [ 6 ] Este límite de difracción es el estándar por el cual se miden todos los métodos de superresolución. Debido a que STED desactiva selectivamente la fluorescencia, puede lograr una resolución mejor que la microscopía confocal tradicional. La fluorescencia normal ocurre al excitar un electrón del estado fundamental a un estado electrónico excitado de un nivel de energía fundamental diferente (S0 va a S1) que, después de relajarse de nuevo al estado fundamental vibracional (de S1), emite un fotón al caer de S1 a un nivel de energía vibracional en S0. La técnica STED interrumpe este proceso antes de que se libere el fotón. El electrón excitado se ve obligado a relajarse a un estado vibracional superior al que alcanzaría la transición de fluorescencia, lo que provoca que el fotón liberado se desplace hacia el rojo, como se muestra en la imagen de la derecha. [ 7 ] Debido a que el electrón pasa a un estado vibracional superior, la diferencia de energía entre ambos estados es menor que la diferencia de fluorescencia normal. Esta disminución de energía aumenta la longitud de onda y provoca que el fotón se desplace aún más hacia el extremo rojo del espectro. Este desplazamiento permite diferenciar los dos tipos de fotones y permite ignorar el fotón estimulado.

Para forzar esta emisión alternativa, un fotón incidente debe impactar el fluoróforo. Esta necesidad de ser impactado por un fotón incidente tiene dos implicaciones para STED. Primero, el número de fotones incidentes impacta directamente la eficiencia de esta emisión y, segundo, con un número suficientemente grande de fotones, la fluorescencia puede suprimirse por completo. [ 8 ] Para lograr el gran número de fotones incidentes necesarios para suprimir la fluorescencia, el láser utilizado para generar los fotones debe ser de alta intensidad. Desafortunadamente, este láser de alta intensidad puede provocar el fotoblanqueo del fluoróforo. El fotoblanqueo es el nombre que recibe la destrucción de fluoróforos por luz de alta intensidad.

Proceso

Comparación entre la microscopía confocal y la microscopía STED. Esto demuestra la mayor resolución de la microscopía STED en comparación con las técnicas tradicionales.
Punto de excitación (2D, izquierda), punto de desexcitación en forma de rosquilla (centro) y área restante que permite la fluorescencia (derecha).

STED funciona agotando la fluorescencia en regiones específicas de la muestra, mientras que deja un punto focal central activo para emitir fluorescencia. Esta área focal se puede diseñar alterando las propiedades del plano de la pupila de la lente del objetivo. [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] El ejemplo más común de estos elementos ópticos difractivos (DOE) es una forma de toroide utilizada en el confinamiento lateral bidimensional que se muestra a continuación. La zona roja se agota, mientras que el punto verde permanece activo. Este DOE se genera mediante una polarización circular del láser de agotamiento, combinada con un vórtice óptico . La resolución lateral de este DOE suele estar entre 30 y 80 nm. Sin embargo, se han reportado  valores de hasta 2,4 nm. [ 12 ] Utilizando diferentes DOE, se ha demostrado una resolución axial del orden de 100 nm. [ 13 ] Una ecuación de Abbe modificada describe esta resolución de subdifracción como:  

D=λ2nortepecado⁡α1+IIse sentó=λ2norteA1+σ{\displaystyle \mathrm {D} ={\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }{\sqrt {1+{\frac {I}{I_{\text{sat}}}}}}}}={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} {\sqrt {1+\sigma }}}}}

Dóndenorte{\textstyle n}es el índice de refracción del medio,I{\textstyle I}es la intensidad intracavitaria yIse sentó{\textstyle I_{\text{sat}}}es la intensidad de saturación . Dondeσ{\textstyle \sigma }es el factor de saturación que expresa la relación entre la intensidad STED aplicada (máxima) y la intensidad de saturación,σ=Imáximo/Ise sentó{\textstyle \sigma =I_{\text{max}}/I_{\text{sat}}}. [ 6 ] [ 14 ]

Para optimizar la eficacia de la técnica STED, la interferencia destructiva en el centro del punto focal debe ser lo más cercana a la perfección posible. Esto impone ciertas limitaciones a la óptica que se puede utilizar.

Tintes

En los inicios del desarrollo de STED, el número de colorantes que podían utilizarse en el proceso era muy limitado. La rodamina B se mencionó en la primera descripción teórica de STED. [ 2 ] Como resultado, los primeros colorantes utilizados emitían luz láser en el espectro rojo. Para permitir el análisis STED de sistemas biológicos, los colorantes y las fuentes láser deben adaptarse al sistema. Este deseo de un mejor análisis de estos sistemas ha dado lugar a STED de células vivas y STED multicolor, pero también ha exigido colorantes y sistemas de excitación cada vez más avanzados para dar cabida a la mayor funcionalidad. [ 7 ]

Uno de estos avances fue el desarrollo de células inmunomarcadas. Estas células son colorantes fluorescentes STED unidos a anticuerpos mediante enlaces amida. El primer uso de esta técnica acopló MR-121SE, un colorante rojo, con un anticuerpo secundario anti-ratón. [ 8 ] Desde esa primera aplicación, esta técnica se ha aplicado a una gama mucho más amplia de colorantes, incluyendo el emisor verde, Atto 532, [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] y el emisor amarillo, Atto 590, [ 18 ] así como otros colorantes emisores rojos. Además, Atto 647N se utilizó por primera vez con este método para producir STED de dos colores. [ 19 ]

Aplicaciones

En los últimos años, la técnica STED ha evolucionado de ser una técnica compleja y altamente específica a un método de fluorescencia general. Como resultado, se han desarrollado diversos métodos para ampliar la utilidad de STED y permitir obtener más información.

Análisis estructural

Desde el inicio del proceso, STED ha permitido que la microscopía de fluorescencia realice tareas que antes solo eran posibles con la microscopía electrónica. Por ejemplo, STED se utilizó para el estudio de la estructura de proteínas a nivel suborgánulo. La prueba común de este nivel de estudio es la observación de filamentos del citoesqueleto. Además, los neurofilamentos , la actina y la tubulina se utilizan frecuentemente para comparar el poder de resolución de los microscopios STED y confocales. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]

 Utilizando STED, se ha logrado una resolución lateral de 70 a 90 nm al examinar SNAP25 , una proteína humana que regula la fusión de membranas. Esta observación ha demostrado que SNAP25 forma cúmulos independientemente de la funcionalidad del motivo SNARE y se une a la sintaxina agrupada. [ 23 ] [ 24 ] Los estudios de orgánulos complejos, como las mitocondrias, también se benefician de la microscopía STED para el análisis estructural. Utilizando microscopios STED personalizados con una resolución lateral inferior a 50 nm, se encontró que  las proteínas mitocondriales Tom20 , VDAC1 y COX2 se distribuyen como cúmulos a nanoescala. [ 25 ] [ 26 ] Otro estudio utilizó una microscopía STED casera y un colorante fluorescente de unión al ADN , y midió longitudes de fragmentos de ADN con mucha más precisión que la medición convencional con microscopía confocal . [ 27 ]

Métodos correlativos

Debido a su funcionalidad, la microscopía STED se puede utilizar con frecuencia junto con otros métodos de alta resolución. La resolución de la microscopía electrónica y de fuerza atómica es incluso mejor que la de STED, pero al combinar la fuerza atómica con STED, Shima et al. lograron visualizar el citoesqueleto de actina de células de cáncer de ovario humano mientras observaban cambios en la rigidez celular. [ 28 ]

Multicolor

STED multicolor se desarrolló en respuesta a un problema creciente en el uso de STED para estudiar la dependencia entre estructura y función en proteínas. Para estudiar este tipo de sistema complejo, se deben usar al menos dos fluoróforos separados. Usando dos colorantes fluorescentes y pares de haces, es posible la obtención de imágenes colocalizadas de grupos de proteínas sinápticas y mitocondriales con una resolución de hasta 5  nm [18]. STED multicolor también se ha usado para mostrar que diferentes poblaciones de proteínas de vesículas sinápticas no se mezclan de botones sinápticos de escape. [ 29 ] [ 30 ] Al usar STED de dos colores con imágenes de vida media múltiple, es posible STED de tres canales.

Célula viva

Inicialmente, se pensó que STED sería una técnica útil para trabajar con células vivas. [ 13 ] Desafortunadamente, la única forma de estudiar las células era marcando la membrana plasmática con colorantes orgánicos. [ 29 ] La combinación de STED con espectroscopia de correlación de fluorescencia mostró que los complejos moleculares mediados por colesterol atrapan esfingolípidos , pero solo transitoriamente. [ 31 ] Sin embargo, solo las proteínas fluorescentes permiten visualizar cualquier orgánulo o proteína en una célula viva. Se demostró que este método funciona con  una resolución lateral de 50 nm en células de mamíferos que expresan citrina-tubulina. [ 32 ] [ 33 ] Además de detectar estructuras en células de mamíferos, STED ha permitido la visualización de proteínas PIN marcadas con YFP agrupadas en la membrana plasmática de células vegetales. [ 34 ]

Recientemente, se realizó STED multicolor de células vivas utilizando un láser pulsado de rojo lejano y la expresión de CLIPf-tag y SNAPf-tag. [ 35 ]

En el cerebro de animales intactos

Las capas superficiales de la corteza del ratón pueden visualizarse repetidamente a través de una ventana craneal. [ 36 ] Esto permite seguir el destino y la forma de las espinas dendríticas individuales durante muchas semanas. [ 37 ] Con STED de dos colores, incluso es posible resolver la nanoestructura de la densidad postsináptica en animales vivos. [ 38 ]

STED a precios de vídeo y más allá.

La superresolución requiere píxeles pequeños, lo que significa más espacios para adquirir en una muestra determinada, lo que conlleva un tiempo de adquisición más prolongado. Sin embargo, el tamaño del punto focal depende de la intensidad del láser utilizado para el agotamiento. Como resultado, este tamaño de punto se puede ajustar, cambiando el tamaño y la velocidad de imagen. De esta manera, se puede alcanzar un compromiso entre estos dos factores para cada tarea de imagen específica. Se han registrado velocidades de 80 fotogramas por segundo, con puntos focales de alrededor de 60  nm. [ 1 ] [ 39 ] Se pueden alcanzar hasta 200 fotogramas por segundo para campos de visión pequeños. [ 40 ]

Problemas

El fotoblanqueo puede ocurrir por excitación a un estado excitado aún más alto, o por excitación en el estado triplete . Para evitar la excitación de un electrón excitado a otro estado excitado más alto, la energía del fotón necesaria para desencadenar la emisión alternativa no debe superponerse con la energía de la excitación de un estado excitado a otro. [ 41 ] Esto asegurará que cada fotón láser que contacte con los fluoróforos cause emisión estimulada y no excite al electrón a otro estado de mayor energía. Los estados triplete tienen una vida útil mucho mayor que los estados singlete, y para evitar la excitación de los estados triplete, el tiempo entre pulsos láser debe ser lo suficientemente largo como para permitir que el electrón se relaje mediante otro método de desactivación, o bien se debe añadir un compuesto químico para desactivar el estado triplete. [ 20 ] [ 42 ] [ 43 ]

Véase también

Referencias

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  • Panorama general del Departamento de Nanobiofotónica del Instituto Max Planck de Química Biofísica .
  • Breve resumen de las ecuaciones RESOLFT desarrolladas por Stefan Hell .
  • Conferencia de Stefan Hell: Superresolución: Descripción general y microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED). Archivada el 16 de octubre de 2014 en Wayback Machine.
  • Microscopía óptica: Una revolución contemporánea en curso (Revisión introductoria)