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Articulo de referencia

Ensayo de respuesta de dinámica estructural

El ensayo de respuesta dinámica estructural (SDR) es un tipo de prueba biofísica que se utiliza para medir la unión de un ligando a una proteína diana . El ensayo se configura c...

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El ensayo de respuesta dinámica estructural (SDR) es un tipo de prueba biofísica que se utiliza para medir la unión de un ligando a una proteína diana . El ensayo se configura como un formato sencillo de mezcla y lectura que se puede realizar con volúmenes muy bajos, por lo que resulta adecuado para aplicaciones de descubrimiento de fármacos, como el cribado de alto rendimiento (HTS), o en el desarrollo de un fármaco candidato durante los ciclos de optimización de la química medicinal .

Figura 1. Concepto del ensayo de respuesta de dinámica estructural (SDR). (arriba) El SDR se basa en la detección de un evento de unión de ligando en una proteína diana de interés (TOI) a través del cambio en la intensidad de la luz de una luciferasa unida. En la figura, la fusión TOI (rojo)-luciferasa (rombo amarillo) representa una proteína en varias conformaciones antes de la unión del ligando. La TOI unida al ligando (azul)-luciferasa (estrella amarilla) representa la TOI con una conformación más restringida y la luminiscencia amplificada resultante . (abajo) Gráficos de respuesta de concentración que ilustran un evento típico de unión de ligando medido ya sea por la inhibición de la actividad funcional de la TOI (curva negra) o SDR (curvas azules), donde la unión del ligando resulta en una ganancia de señal que puede variar en amplitud dependiendo de la naturaleza de la TOI y el ligando.

Principio

El ensayo de unión de ligando SDR se basa en la observación de que la unión de un ligando a una proteína diana de interés (PDI) puede afectar la intensidad de la señal de una enzima sensora asociada (Figura 1). Los estudios iniciales sugieren que el ensayo SDR puede ser útil para un amplio espectro de proteínas, incluyendo dianas farmacológicas y proteínas de interés agroquímico . [ 1 ] [ 2 ]

El ensayo SDR parece aprovechar los cambios inducidos por el ligando en la dinámica estructural o la conformación de la proteína diana ( dinámica proteica ) para modular la luminiscencia de una enzima sensora fusionada al extremo N o C de dicha proteína. El ensayo SDR no requiere un ligando competitivo, como sí es necesario en técnicas como el inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FP) [ 3 ] u otros ensayos de unión competitiva similares. Además, el ensayo SDR es independiente de la función de la proteína diana. Esto es de particular importancia para las enzimas que catalizan reacciones cuyos sustratos son, por ejemplo, inalcanzables, inestables o desconocidos.

Se ha demostrado que este método detecta la unión de asciminib al sitio de unión del ácido mirístico del dominio de la tirosina quinasa de Abelson . Esto es relevante porque asciminib no inhibe la actividad catalítica de la tirosina quinasa en ensayos bioquímicos que miden la fosforilación del sustrato o el recambio de ATP del cofactor , lo que sugiere que el ensayo SDR puede ser útil para detectar ligandos que se unen a sitios alostéricos .

Se ha demostrado la generalidad del método con varias clases de enzimas utilizando la luciferasa Nanoluc (NLuc) intacta o la secuencia HiBiT de 11 aminoácidos que permite la alfa-complementación. [ 4 ] Se ha demostrado que la altísima sensibilidad del método permite evaluar un TOI probado como el lisado celular obtenido mediante la edición del gen diana mediada por CRISPR/Cas9 .

Solicitud

El ensayo SDR se ha demostrado en el cribado cuantitativo de alto rendimiento (qHTS) [ 5 ] en formato de placa de microtitulación de 1536 pocillos con enzimas de las siguientes clases de enzimas : monooxigenasa dependiente del cofactor ATP utilizando luciferasa de luciérnaga (FLuc); [ 6 ] oxidorreductasa utilizando dihidrofolato reductasa (DHFR); [ 7 ] tirosina quinasa utilizando el dominio de tirosina quinasa de Abelson (ABL1); [ 8 ] proteína quinasa de serina/treonina utilizando proteína quinasa A (PKA); [ 9 ] isomerasa utilizando fosfoglicerato mutasa independiente del cofactor (iPGM); [ 10 ] ligasas de ADN dependientes de NAD+ y ATP, utilizando la ligasa de ADN de E. coli [ 11 ] y la ligasa de ADN del bacteriófago T7 , [ 12 ] respectivamente.

Referencias

  1. ↑ Ciulla, DA; Dranchak, PK; Aitha, M.; van Neer, RHP; Shah, D.; Tharakan, R.; Wilson, KM; Wang, Y.; Braisted, JC; Inglese, J. (2025). "Una plataforma de ensayo general para estudiar la farmacología de proteínas utilizando dinámica estructural dependiente del ligando" . Nat Commun . 16 (1) 4342. Bibcode : 2025NatCo..16.4342C . doi : 10.1038/ s41467-025-59658-6 . PMC 12064818. PMID 40346061 .  
  2. ↑ Lowe, D. (1 de julio de 2025). "Los nuevos ensayos siempre son bienvenidos" . En desarrollo .
  3. ↑ Lea, WA; Simeonov, A. (2011). "Ensayos de polarización de fluorescencia en la detección de moléculas pequeñas" . Expert Opinion on Drug Discovery . 6 (1): 17– 32. doi : 10.1517/17460441.2011.537322 . PMC 3277431. PMID 22328899 .  
  4. ↑ Schwinn, MK; Machleidt, T.; Zimmerman, K.; Eggers, CT; Dixon, AS; Hurst, R.; Hall, MP; Encell, LP; Binkowski, BF; Wood, KV (2018). "Un etiquetado mediado por CRISPR de proteínas endógenas con un péptido luminiscente" . ACS Chem Biol . 13 (2): 467– 474. doi : 10.1021/acschembio.7b00549 . PMID 28892606 . 
  5. ↑ Inglese, J.; Auld, DS; Jadhav, A.; Johnson, RL; Simeonov, A.; Yasgar, A.; Zheng, W.; Austin, CP (2006). "Cribado cuantitativo de alto rendimiento (qHTS): un enfoque basado en titulación que identifica eficientemente actividades biológicas en grandes bibliotecas químicas" . Proc . Natl. Acad. Sci. USA . 103 (31): 11473– 11478. doi : 10.1073/pnas.0604348103 . PMC 1518803. PMID 16864780 .  
  6. ↑ Thorne, N.; Shen, M.; Lea, WA; Simeonov, A.; Lovell, S.; Auld, DS; Inglese, J. (2012). "Luciferasa de luciérnaga en biología química: un compendio de inhibidores, evaluación mecanística de quimiotipos y uso sugerido como reportero" . Química y biología . 19 (8): 1060– 1072. doi : 10.1016/j.chembiol.2012.07.015 . PMC 3449281. PMID 22921073 .  
  7. ↑ Benkovic, SJ; Fierke, CA; Naylor, AM (1988). "Perspectivas sobre la función enzimática a partir de estudios sobre mutantes de dihidrofolato-reductasa". Science . 239 (4844): 1105– 1110. Bibcode : 1988Sci...239.1105B . doi : 10.1126/science.3125607 . PMID 3125607 . 
  8. ↑ Nagar, B.; Hantschel, O.; Young, MA; Scheffzek, K.; Veach, D.; Bornmann, W.; Clarkson, B.; Superti-Furga, G.; Kuriyan, J. (2003). "Base estructural de la autoinhibición de la tirosina quinasa c-Abl". Cell . 112 (6): 859– 871. doi : 10.1016/s0092-8674(03)00194-6 . PMID 12654251 . 
  9. ↑ Taylor, SS; Zhang, P.; Steichen, JM; Keshwani, MM; Kornev, AP (2013). "PKA: lecciones aprendidas después de veinte años" . Biochim . Biophys. Acta . 1834 (7): 1271– 1278. doi : 10.1016/j.bbapap.2013.03.007 . PMC 3763834. PMID 23535202 .  
  10. ↑ Weidmann, M.; Dranchak, PK; Aitha, M.; Lamy, L.; Collmus, CD; Queme, B.; Kanter, L.; Battaile, KP; Rai, G.; Lovell, S.; Suga, H.; Inglese, J. (2021). "Relación estructura-actividad de la unión de ipglycermide a las fosfoglicerato mutasas" . J. Biol. Chem . 296 100628. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100628 . PMC 8113725. PMID 33812994 .  
  11. ↑ Pergolizzi, G.; Wagner, GK; Bowater, RP (2016). "Caracterización bioquímica y estructural de las ADN ligasas de bacterias y arqueas" . Biosci . Rep . 36 (5) e00391: 00391. doi : 10.1042/BSR20160003 . PMC 5052709. PMID 27582505 .  
  12. ↑ Doherty, AJ; Ashford, SR; Subramanya, HS; Wigley, DB (1996). "ADN ligasa del bacteriófago T7. Sobreexpresión, purificación, cristalización y caracterización" . J. Biol. Chem . 271 (19): 11083– 11089. doi : 10.1074/jbc.271.19.11083 . PMID 8626651 .