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Imágenes de fluctuación óptica de superresolución

La técnica de imagen por fluctuación óptica de superresolución ( SOFI , por sus siglas en inglés) es un método de postprocesamiento para el cálculo de imágenes de superresolució...

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La técnica de imagen por fluctuación óptica de superresolución ( SOFI , por sus siglas en inglés) es un método de postprocesamiento para el cálculo de imágenes de superresolución a partir de series temporales de imágenes registradas , que se basa en las correlaciones temporales de emisores fluorescentes que fluctúan de forma independiente.

SOFI se ha desarrollado para la superresolución de muestras biológicas que están marcadas con emisores fluorescentes fluctuantes independientes (colorantes orgánicos, proteínas fluorescentes ). En comparación con otras técnicas de microscopía de superresolución como STORM o PALM que dependen de la localización de una sola molécula y por lo tanto solo permiten una molécula activa por área limitada por difracción (DLA) y punto de tiempo, [ 1 ] [ 2 ] SOFI no requiere una fotoactivación y/o fotoconmutación controlada así como largos tiempos de imagen. [ 3 ] [ 4 ] Sin embargo, todavía requiere fluoróforos que ciclan a través de dos estados distinguibles, ya sean estados reales encendido/apagado o estados con diferentes intensidades de fluorescencia. En términos matemáticos, la imagen SOFI se basa en el cálculo de cumulantes , para lo cual existen dos formas distinguibles. Por un lado, una imagen se puede calcular mediante autocumulantes [ 3 ] que, por definición, solo dependen de la información de cada píxel; por otro lado, un método mejorado utiliza la información de diferentes píxeles mediante el cálculo de cumulantes cruzados [ 5 ] . Ambos métodos pueden aumentar significativamente la resolución final de la imagen, aunque el cálculo de cumulantes tiene sus limitaciones. De hecho, SOFI es capaz de aumentar la resolución en las tres dimensiones [ 3 ] .

Principio

Principio del cálculo autocumulante de SOFI (A) Representación esquemática de una cuadrícula de píxeles CCD que contiene varias señales de emisores (B) Recorte de dos fluoróforos con sus señales convolucionadas con la PSF del sistema, registradas en una pila de imágenes (C) Las señales en cada píxel se evalúan mediante el cálculo cumulante (un proceso que puede entenderse en términos de correlación e integración)

Al igual que otros métodos de superresolución, SOFI se basa en el registro de una serie temporal de imágenes en una cámara CCD o CMOS. A diferencia de otros métodos, la serie temporal registrada puede ser sustancialmente más corta, ya que no se requiere una localización precisa de los emisores y, por lo tanto, se permite una mayor cantidad de fluoróforos activados por área limitada por difracción. Los valores de píxel de una imagen SOFI de orden n se calculan a partir de los valores de la serie temporal de píxeles en forma de un cumulante de orden n , mientras que el valor final asignado a un píxel puede imaginarse como la integral sobre una función de correlación. Las intensidades del valor de píxel finalmente asignado son una medida del brillo y la correlación de la señal de fluorescencia. Matemáticamente, el cumulante de orden n está relacionado con la función de correlación de orden n , pero presenta algunas ventajas con respecto a la resolución resultante de la imagen. Dado que en SOFI se permiten varios emisores por DLA, el recuento de fotones en cada píxel resulta de la superposición de las señales de todos los emisores cercanos activados. El cálculo de cumulantes ahora filtra la señal y deja solo las fluctuaciones altamente correlacionadas. Esto proporciona una mejora del contraste y, por lo tanto, una reducción del fondo. Como se muestra en la figura de la izquierda, la distribución de la fuente de fluorescencia es la siguiente:

∑k=1norteδ(r→−r→k)⋅εk⋅sk(t){\displaystyle \sum _{k=1}^{N}\delta ({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t)}

se convoluciona con la función de dispersión puntual (PSF) del sistema U ( r ). Por lo tanto, la señal de fluorescencia en el tiempo t y la posiciónr→{\displaystyle {\vec {r}}}es dado por

F(r→,t)=∑k=1norteU(r→−r→k)⋅εk⋅sk(t).{\displaystyle F({\vec {r}},t)=\sum _{k=1}^{N}U({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t).}

En las ecuaciones anteriores, N es la cantidad de emisores, ubicados en las posicionesr→k{\displaystyle {\vec {r}}_{k}}con un brillo molecular dependiente del tiempoεk⋅sk{\displaystyle \varepsilon _ {k} \ cdot s_ {k}}dóndeεk{\displaystyle \varepsilon _{k}}es una variable para el brillo molecular constante ysk(t){\displaystyle s_{k}(t)}es una función de fluctuación dependiente del tiempo. El brillo molecular es simplemente la tasa de conteo de fluorescencia promedio dividida por el número de moléculas dentro de una región específica. Para simplificar, se debe asumir que la muestra está en equilibrio estacionario y, por lo tanto, la señal de fluorescencia puede expresarse como una fluctuación de media cero:

δF(r→,t)=F(r→,t)−⟨F(r→,t)⟩t{\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=F({\vec {r}},t)-\langle F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}

dónde⟨⋯⟩t{\displaystyle \langle \cdots \rangle _ {t}}denota el promedio temporal. La autocorrelación aquí, por ejemplo, la de segundo orden, puede describirse deductivamente de la siguiente manera para un cierto retardo temporal.τ{\displaystyle \tau }:

δF(r→,t)=⟨δF(r→,t+τ)⋅δF(r→,t)⟩t{\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=\langle \delta F({\vec {r}},t+\tau )\cdot \delta F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}

De estas ecuaciones se deduce que la PSF del sistema óptico debe elevarse a la potencia del orden de la correlación. Por lo tanto, en una correlación de segundo orden, la PSF se reduciría en todas las dimensiones por un factor de2{\displaystyle {\sqrt {2}}}Como resultado, la resolución de las imágenes SOFI aumenta en función de este factor.

Cumulantes frente a correlaciones

Utilizar únicamente la función de correlación simple para la reasignación de valores de píxeles implicaría la independencia de las fluctuaciones de los emisores en el tiempo, de manera que ningún término de correlación cruzada contribuiría al nuevo valor del píxel. Los cálculos de funciones de correlación de orden superior se verían afectados por las correlaciones de orden inferior, por lo que resulta superior calcular los cumulantes, ya que todos los términos de correlación de orden inferior se anulan.

Cálculo de cumulantes

Autocumulantes

Por razones computacionales, es conveniente establecer todos los retardos de tiempo en los cumulantes de orden superior a cero para que se pueda encontrar una expresión general para el autocumulante de orden n : [ 3 ]

Adonorte(r→,τ1…norte−1=0)=∑k=1norteUnorte(r→−r→k)εknortewk(0){\displaystyle AC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\sum _{k=1}^{N}U^{n}({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\varepsilon _{k}^{n}w_{k}(0)}

wk{\displaystyle w_{k}}es una función de ponderación específica basada en la correlación, influenciada por el orden del cumulante y que depende principalmente de las propiedades de fluctuación de los emisores.

Aunque no existe una limitación fundamental en el cálculo de órdenes muy altas de cumulantes y, por lo tanto, en la reducción del FWHM de la PSF, existen limitaciones prácticas según la ponderación de los valores asignados a la imagen final. Los emisores con un brillo molecular más alto mostrarán un fuerte aumento en términos del valor del cumulante del píxel asignado en órdenes superiores, y este rendimiento puede esperarse de una apariencia diversa de fluctuaciones de diferentes emisores. Por lo tanto, puede esperarse un amplio rango de intensidad de la imagen resultante y, como resultado, los emisores débiles pueden quedar enmascarados por emisores brillantes en imágenes de orden superior: [ 3 ] [ 5 ] El cálculo de autocumulantes puede realizarse de una manera muy atractiva en un sentido matemático. El cumulante de orden n puede calcularse con una recursión básica a partir de momentos [ 6 ]

Knorte(r→)=μnorte(r→)−∑i=1norte−1(norte−1i)Knorte−i(r→)μi(r→){\displaystyle K_{n}({\vec {r}})=\mu _{n}({\vec {r}})-\sum _{i=1}^{n-1}{\begin{pmatrix}n-1\\i\end{pmatrix}}K_{ni}({\vec {r}})\mu _{i}({\vec {r}})}

donde K es un cumulante del orden del índice, de igual maneraμ{\displaystyle \mu }representa los momentos. El término entre corchetes indica un coeficiente binomial . Este método de cálculo es sencillo en comparación con el cálculo de cumulantes mediante fórmulas estándar. Permite calcular cumulantes con poco tiempo de procesamiento y, gracias a su buena implementación, resulta adecuado incluso para el cálculo de cumulantes de orden superior en imágenes de gran tamaño.

Cumulantes cruzados

Principios del cálculo de cumulantes cruzados y factor de distancia de SOFI: (A) Cálculo de cumulantes cruzados de cuarto orden con "combinaciones con repeticiones". (B) Decaimiento del factor de distancia a lo largo de las flechas.

En un enfoque más avanzado, los cumulantes cruzados se calculan teniendo en cuenta la información de varios píxeles. Los cumulantes cruzados se pueden describir de la siguiente manera: [ 5 ] [ 7 ]

dodonorte(r→,τ1…norte−1=0)=∏j<lnorteU(r→j−r→lnorte)⋅∑i=1norteUnorte(r→i−∑knorter→knorte)εinortewi(0){\displaystyle CC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\prod _{j<l}^{n}U{\Bigg (}{\frac {{\vec {r}}_{j}-{\vec {r}}_{l}}{\sqrt {n}}}{\Bigg )}\cdot \sum _{i=1}^{N}U^{n}{\Bigg (}{\vec {r}}_{i}-{\frac {\sum _{k}^{n}{\vec {r}}_{k}}{n}}{\Bigg )}\varepsilon _{i}^{n}w_{i}(0)}

j , l y k son índices para los píxeles que contribuyen, mientras que i es el índice para la posición actual. Todos los demás valores e índices se utilizan como antes. La principal diferencia en la comparación de esta ecuación con la ecuación para los autocumulantes es la aparición de un factor de ponderación.U(rj−rl/norte){\displaystyle U(r_{j}-r_{l}/{\sqrt {n}})}Este factor de ponderación (también denominado factor de distancia) tiene forma de PSF y depende de la distancia entre los píxeles correlacionados, de modo que la contribución de cada píxel disminuye con la distancia siguiendo una función de PSF. En principio, esto significa que el factor de distancia es menor para los píxeles más alejados. El método de cumulantes cruzados permite crear nuevos píxeles virtuales que revelan información precisa sobre la muestra etiquetada, reduciendo el tamaño efectivo del píxel. Estos píxeles contienen más información que los píxeles resultantes de una simple interpolación.

Además, el método de cumulantes cruzados puede utilizarse para estimar la PSF del sistema óptico aprovechando las diferencias de intensidad de los píxeles virtuales debidas a la "pérdida" en la correlación cruzada, como se mencionó anteriormente. [ 5 ] Cada píxel virtual puede ser reponderado con el inverso del factor de distancia del píxel, lo que permite restaurar el verdadero valor del cumulante. Finalmente, la PSF puede utilizarse para crear una dependencia de resolución de n para el cumulante de orden n mediante la reponderación de la " función de transferencia óptica " (OTF). [ 5 ] Este paso también puede sustituirse por el uso de la PSF para una deconvolución que conlleva un menor coste computacional.

El cálculo de cumulantes cruzados requiere el uso de una fórmula computacional mucho más costosa que comprende el cálculo de sumas sobre particiones. Esto se debe, por supuesto, a la combinación de diferentes píxeles para asignar un nuevo valor. Por lo tanto, no se puede utilizar un enfoque recursivo rápido en este punto. Para el cálculo de cumulantes cruzados se puede utilizar la siguiente ecuación: [ 8 ]

Knorte(r→=1norte∑i=1norteri→)=∑PAG(−1)|PAG|−1(|PAG|−1)¡∏pag∈PAG⟨∏i∈pagF(r→)i⟩t{\displaystyle K_{n}{\Bigg (}{\vec {r}}={\frac {1}{n}}\sum _{i=1}^{n}{\vec {r_{i}}}{\Bigg )}=\sum _{P}(-1)^{|P|-1}(|P|-1)!\prod _{p\in P}{\Big \langle }\prod _{i\in p}F({\vec {r}})_{i}{\Big \rangle }_{t}}

En esta ecuación, P denota la cantidad de particiones posibles, p denota las diferentes partes de cada partición. Además, i es el índice para las diferentes posiciones de píxeles consideradas durante el cálculo, que para F es simplemente la pila de imágenes de los diferentes píxeles contribuyentes. El enfoque de cumulante cruzado facilita la generación de píxeles virtuales dependiendo del orden del cumulante, como se mencionó anteriormente. Estos píxeles virtuales se pueden calcular en un patrón particular a partir de los píxeles originales para una imagen de cumulante cruzado de cuarto orden, como se muestra en la imagen inferior, parte A. El patrón en sí surge simplemente del cálculo de todas las combinaciones posibles de los píxeles de la imagen original A, B, C y D. Aquí esto se hizo mediante un esquema de "combinaciones con repeticiones". Los píxeles virtuales exhiben una pérdida de intensidad que se debe a la correlación misma. La parte B de la segunda imagen muestra esta dependencia general de los píxeles virtuales de la correlación cruzada. Para restaurar valores de píxeles significativos, la imagen se suaviza mediante una rutina que define un factor de distancia para cada píxel de la cuadrícula de píxeles virtual de manera similar a una PSF y aplica el inverso a todos los píxeles de la imagen que están relacionados con el mismo factor de distancia. [ 5 ] [ 7 ]

Referencias

  1. ↑ Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess: Visualización de proteínas fluorescentes intracelulares con resolución nanométrica , Science , vol. 313, n.º 5793, 2006, págs. 1642-1645. doi : 10.1126/science.1127344
  2. ↑ S. vdLinde, A. Löschberger, T. Klein, M. Heidbreder, S. Wolter, M. Heilemann, M. Sauer: Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa con sondas fluorescentes estándar , Nature Protocols , vol. 6, 2011, pp. 991–1009. doi : 10.1038/nprot.2011.336
  3. 1 2 3 4 5 T. Dertinger, R. Colyer, G. Iyer, S. Weiss, J. Enderlein: Imágenes de fluctuación óptica de superresolución 3D rápidas y sin ruido de fondo (SOFI) , PNAS , vol. 106, n.º 52, 2009, págs. 22287–22292. doi : 10.1073/pnas.0907866106
  4. ↑ S. Geissbuehler, C. Dellagiacoma, T. Lasser: Comparación entre SOFI y STORM , Biomedical Optics Express , vol. 2, núm. 3, 2011, págs. 408–420. doi : 10.1364/BOE.2.000408
  5. 1 2 3 4 5 6 T. Dertinger, R. Colyer, R. Vogel, J. Enderlein, S. Weiss: Lograr mayor resolución y más píxeles con imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) , Optics Express , vol. 18, número 18, 2010, págs. 18875–18885. doi : 10.1364/OE.18.018875
  6. ↑ PT Smith: Una formulación recursiva del antiguo problema de obtener momentos a partir de cumulantes y viceversa , The American Statistician , vol. 49, número 2, 1995, págs. 217-218. doi : 10.1080/00031305.1995.10476146
  7. 1 2 S. Geissbuehler, NL Bocchio, C. Dellagiacoma, C. Berclaz, M. Leutenegger, T. Lasser: Mapeo de estadísticas moleculares con imágenes de fluctuación óptica de superresolución balanceada (bSOFI) , Nanoscopía Óptica , Vol. 1, 2012, pp. 1–4. doi : 10.1186/2192-2853-1-4
  8. ↑ JM Mendel: Tutorial sobre estadísticas de orden superior (espectros) en procesamiento de señales y teoría de sistemas: resultados teóricos y algunas aplicaciones , Actas del IEEE , vol. 79, número 3, 1991, págs. 278-297. doi : 10.1109/5.75086