TCP-seq

La secuenciación del perfil del complejo de traducción ( TCP-seq ) es un método de biología molecular para obtener instantáneas de la distribución momentánea de los complejos de síntesis de proteínas a lo largo de las cadenas de ARN mensajero (ARNm). ^{[ 1 ]}

La expresión del código genético en todas las formas de vida consta de dos procesos principales: la síntesis de copias del código genético almacenado en el ADN en forma de ARNm ( transcripción ) y la síntesis de proteínas ( traducción ), mediante la cual las copias del código en el ARNm se decodifican en secuencias de aminoácidos de las proteínas correspondientes. Tanto la transcripción como la traducción son procesos altamente regulados que controlan prácticamente todo lo que sucede en las células vivas (y, por consiguiente, en los organismos multicelulares).

El control de la traducción es especialmente importante en las células eucariotas , donde forma parte de las redes reguladoras postranscripcionales de la expresión génica. Esta funcionalidad adicional se refleja en la mayor complejidad del proceso de traducción , lo que dificulta su investigación. Sin embargo, los detalles sobre cuándo y qué ARNm se traduce, así como los mecanismos responsables de este control, son clave para comprender la funcionalidad celular normal y patológica. La secuenciación TCP (TCP-seq) puede utilizarse para obtener esta información.

Con la llegada de los métodos de identificación de secuencias de ADN y ARN de alto rendimiento (como la secuenciación Illumina ), fue posible analizar de manera eficiente las secuencias de nucleótidos de un gran número de fragmentos de ADN y ARN relativamente cortos. Las secuencias de estos fragmentos se pueden superponer para reconstruir la secuencia original. Alternativamente, si la secuencia original ya se conoce, los fragmentos se pueden localizar dentro de ella ("mapear") y contar su número individual. De este modo, si existe una etapa inicial en la que los fragmentos están presentes de forma diferencial o se seleccionan ("enriquecidos"), este enfoque se puede utilizar para describir cuantitativamente dicha etapa incluso en un número o longitud muy grandes de secuencias de entrada, que generalmente abarcan todo el ADN o ARN de la célula.

TCP-seq se basa en estas capacidades de la secuenciación de ARN de alto rendimiento y, además, utiliza el fenómeno de protección de los ácidos nucleicos . Esta protección se manifiesta como resistencia a la despolimerización o modificación de segmentos de ácidos nucleicos (en particular, ARN) que están fuertemente unidos o englobados con otras biomoléculas, dejando así sus "huellas" sobre la cadena de ácido nucleico. Estos fragmentos de "huella" representan, por lo tanto, la ubicación en la cadena de ácido nucleico donde ocurre la interacción. Al secuenciar y mapear los fragmentos a la secuencia de origen, es posible identificar con precisión la ubicación y la cantidad de estos contactos intermoleculares.

En el caso de TCP-seq, los ribosomas y las subunidades ribosómicas que interactúan con el ARNm se unen químicamente a él mediante un proceso rápido con formaldehído para preservar el estado de interacción existente ("instantánea" de la distribución) y bloquear cualquier posible proceso de no equilibrio. La unión puede realizarse directamente en células vivas, pero no se limita a ellas. A continuación, el ARN se degrada parcialmente ( por ejemplo , con ribonucleasa ) de modo que solo quedan los fragmentos protegidos por los ribosomas o las subunidades ribosómicas. Estos fragmentos protegidos se purifican según la dinámica de sedimentación de los ribosomas o las subunidades ribosómicas unidas, se liberan, se secuencian y se mapean al transcriptoma de origen , lo que permite determinar la ubicación original de los complejos de traducción sobre el ARNm.

TCP-seq combina varios elementos típicos de otros análisis transcriptómicos de este tipo. En particular, se emplean enfoques de perfilado de polisomas ^{[ 2 ] [ 3 ]} y de ribosomas (traducción) ^{[ 4 ]} para identificar el ARNm implicado en la formación de polisomas y la ubicación de los ribosomas en elongación sobre las regiones codificantes de los transcritos, respectivamente. Sin embargo, estos métodos no utilizan la estabilización química de los complejos de traducción ni la purificación de los intermediarios unidos covalentemente a partir de células vivas. Por lo tanto, TCP-seq puede considerarse más como un equivalente funcional de ChIP-seq y métodos similares para investigar las interacciones momentáneas del ADN, rediseñados para su aplicación en la traducción.

Las ventajas del método incluyen:

• campo de visión excepcionalmente amplio (porque se capturan por primera vez complejos de traducción de cualquier tipo, incluidas las subunidades ribosómicas pequeñas de escaneo);
• una representación potencialmente más natural de dinámicas complejas (porque todos los procesos de traducción, y no solo algunos seleccionados, se detienen mediante la fijación con formaldehído);
• Posiblemente una detección más fiel y/o sensible de la ubicación de los complejos de traducción (ya que la fijación covalente evita el desprendimiento de los fragmentos de los ribosomas o sus subunidades).

Las desventajas incluyen:

• mayor complejidad general del procedimiento experimental (debido a la necesidad de aislar inicialmente el ARNm traducido y realizar una sedimentación preparativa para separar los ribosomas y las subunidades ribosómicas);
• mayor contaminación de la profundidad de lectura de secuenciación útil con fragmentos no deseados del ARN ribosómico (heredados de la amplia ventana de selección de tamaño utilizada para los fragmentos de ARN protegidos);
• un requisito previo para la optimización del procedimiento de fijación con formaldehído para cada nuevo tipo de célula o muestra (ya que los tiempos óptimos de fijación con formaldehído dependen en gran medida de la morfología de la muestra y tanto la fijación excesiva como la insuficiente comprometerán los resultados).

El método se encuentra actualmente en desarrollo y se aplicó para investigar la dinámica de la traducción en células de levadura vivas , extendiendo, en lugar de simplemente combinar, las capacidades de las técnicas anteriores. ^{[ 1 ]} El único otro método a nivel de transcriptoma para mapear las posiciones de los ribosomas sobre el ARNm con precisión de nucleótidos es el perfilado de ribosomas (traducción). Sin embargo, captura las posiciones de solo los ribosomas en elongación, y la mayoría de los intermediarios dinámicos y funcionalmente importantes de la traducción en la etapa de iniciación no se detectan.

TCP-seq se diseñó para abordar específicamente estos puntos ciegos. Puede proporcionar esencialmente el mismo nivel de detalle para la fase de elongación que el perfilado de ribosomas (traducción), pero también incluye el registro de intermediarios de iniciación, terminación y reciclaje (y básicamente cualquier otro complejo de traducción posible siempre que el ribosoma o sus subunidades estén en contacto con el ARNm y lo protejan) de la síntesis de proteínas que antes permanecían fuera del alcance. Por lo tanto, TCP-seq proporciona un enfoque único para una comprensión completa del proceso de traducción de una muestra biológica. Se espera que este aspecto particular del método se desarrolle aún más, ya que la dinámica del escaneo ribosomal en el ARNm durante la iniciación de la traducción es generalmente desconocida para la mayor parte de la vida. El conjunto de datos actual que contiene datos de TCP-seq para la iniciación de la traducción está disponible para la levadura Saccharomyces cerevisiae , ^{[ 5 ] [ 6 ]} y es probable que se extienda a otros organismos en el futuro.