Determinación del extremo del ARN acoplado a exones trans-empalmados

La técnica TEC-RED ( Trans-Spliced ​​Exon Coupled RNA End Determination ) es una técnica transcriptómica que, al igual que SAGE , permite la detección digital de secuencias de ARN mensajero. A diferencia de SAGE, la detección y purificación de transcritos del extremo 5' del ARN mensajero requiere la presencia de una secuencia líder trans-spliced.

Las secuencias líderes empalmadas son secuencias cortas de ARN no codificante , que no se encuentran dentro de un gen, y que se unen al extremo 5' de todos, o una porción de, los ARNm transcritos en un organismo. Se ha descubierto que en varias especies son responsables de separar los transcritos policistrónicos en ARNm de un solo gen , y en otras se empalman en transcritos monocistrónicos. ^{[ 1 ]} El papel principal del trans-empalme en los transcritos monocistrónicos es en gran medida desconocido. ^{[ 2 ]} Se ha propuesto que pueden actuar como un promotor independiente que ayuda en la expresión tisular específica de isoformas proteicas independientes. ^{[ 3 ]} Se han visto líderes empalmados en tripanosomátidos, Euglena , platelmintos, Caenorhabditis . ^{[ 1 ] [ 4 ]} Algunas especies contienen solo una secuencia líder empalmada que se encuentra en todos los ARNm. En C. elegans se observan dos y se denominan SL1 y SL2 . ^{[ 5 ]}

Se purifica el ARN total de la muestra de interés. A continuación, se purifica el ARN mensajero poliadenilado (ARNm poliadenilado) del ARN total y posteriormente se traduce a ADNc mediante una reacción de transcripción inversa. El ADNc producido a partir del ARNm se marca utilizando cebadores homólogos a las secuencias líderes de empalme del organismo. En una reacción de PCR de nueve pasos , los ADNc se incorporan simultáneamente al sitio de la endonucleasa de restricción BpmI (aunque cualquier endonucleasa de restricción de clase IIs puede funcionar) y a una etiqueta de biotina presente en los cebadores. Estos ADNc marcados se escinden 14 pb corriente abajo del sitio de reconocimiento utilizando la endonucleasa de restricción BpmI y se les añaden extremos romos con la ADN polimerasa T4. Los fragmentos se purifican aún más, eliminando el material de ADN extraño, mediante la unión de las etiquetas de biotina a una matriz de estreptavidina . Finalmente, se ligan a ADN adaptador en seis reacciones separadas, que contienen seis sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción diferentes. Estas etiquetas se amplifican mediante PCR con cebadores que contienen una secuencia no coincidente, cambiando el sitio Bpm1 por un sitio Xho1. Los amplicones se concatenan y ligan a un vector plasmídico . Los vectores clonales se secuencian y se mapean al genoma. ^{[ 6 ]}

La concatenación de las etiquetas, tal como se desarrolló en 2004, es diferente de la observada en SAGE. La escisión de las etiquetas con Xho1 y la mezcla de las diferentes muestras, seguida de la ligación, forman el primer paso de concatenación. El segundo paso utiliza una de las endonucleasas de restricción con consenso a la molécula adaptadora unida al extremo 3'. Se vuelven a ligar y se realiza una PCR para purificar las muestras para la siguiente unión. La concatenación continúa con la segunda endonucleasa de restricción, seguida de la tercera y finalmente la cuarta. Esto da como resultado el concatámero formado por las seis ligaciones de endonucleasas que contiene 32 etiquetas, dispuestas de 5' a 5' alrededor del sitio Xho1. ^{[ 6 ]} En SAGE, la concatenación tiene lugar después de que se forman y amplifican las ditags mediante PCR. Los enlazadores en el exterior de las ditags se escinden con la enzima que proporcionó su unión y estas ditags de extremo cohesivo se concatenan aleatoriamente y se colocan en un vector de clonación. ^{[ 7 ]}

La ventaja de TEC-RED sobre SAGE es que no se necesita ninguna endonucleasa de restricción para la unión inicial del enlazador. Esto evita el sesgo asociado con las secuencias de sitios de restricción que faltarán en algunos genes, como se observa en SAGE. La capacidad de tener una instantánea de isoformas de ARN específicas permite deducir la regulación diferencial de isoformas a través de la selección alternativa de promotores. ^{[ 8 ]} Esto también puede ayudar a discernir patrones de expresión únicos para la secuencia SL1 o SL2. TEC-RED también permite caracterizar los extremos 5' del ARN producido y, por lo tanto, de las isoformas que difieren por el empalme amino terminal. La tecnología permite la determinación y verificación de todos los genes conocidos y desconocidos que se puedan predecir, así como las isoformas de empalme 5' o los extremos 5' del ARN que se puedan producir. El uso de TEC-RED junto con SAGE o un protocolo modificado permitirá discernir los extremos 5' y 3' de los transcritos, respectivamente. Por lo tanto, es posible identificar variantes de empalme alternativas , y posiblemente las cantidades relativas, que contengan una secuencia líder trans-empalmada.

Se han descrito dos técnicas alternativas que permiten el análisis de etiquetas 5' en organismos que no poseen secuencias líderes trans-empalmadas. Las técnicas presentadas por Toshiyuki et al. y Shin-ichi et al. se denominan CAGE y 5' SAGE, respectivamente. CAGE utiliza la tecnología de captura de capuchón biotinilado para mantener la señal de ARNm el tiempo suficiente para crear y seleccionar ADNc de longitud completa , que tienen secuencias adaptadoras ligadas en el extremo 5'. 5' SAGE utiliza la tecnología de oligo-capping. ^{[ 9 ]} Ambas utilizan su secuencia adaptadora para iniciar la replicación después de la creación del ADNc . Sin embargo, ambos métodos presentan desventajas. CAGE ha mostrado etiquetas con la adición de una guanina en la primera posición y el oligo-capping puede generar sesgos de secuencia debido al uso de la ARN ligasa. ^{[ 10 ]}

• ARN-seq
• microarrays de ADN

• Carninci P, Kvam C, Kitamura A, et  al. (noviembre de 1996). "Clonación de ADNc de longitud completa de alta eficiencia mediante un atrapador CAP biotinilado". Genomics . 37 (3): 327– 36. doi : 10.1006/geno.1996.0567 . PMID 8938445 . 
• Hashimoto S, Suzuki Y, Kasai Y, et  al. (septiembre de 2004). "SAGE del extremo 5' para el análisis de sitios de inicio de la transcripción". Nat . Biotechnol . 22 (9): 1146– 9. doi : 10.1038/nbt998 . PMID 15300261. S2CID 5485989 .  
• Shiraki T, Kondo S, Katayama S, et  al. (diciembre de 2003). "Análisis de la expresión génica mediante el método Cap para el análisis de alto rendimiento del punto de inicio de la transcripción y la identificación del uso del promotor" . Proc . Natl. Acad. Sci. USA . 100 (26): 15776–81 . Bibcode : 2003PNAS..10015776S . doi : 10.1073/pnas.2136655100 . PMC 307644. PMID 14663149 .  
• Zorio DA, Cheng NN, Blumenthal T, Spieth J (noviembre de 1994). "Los operones como una forma común de organización cromosómica en C. elegans". Nature . 372 ( 6503): 270–2 . Bibcode : 1994Natur.372..270Z . doi : 10.1038/372270a0 . PMID 7969472. S2CID 4257343 .  

• Etiquetas CAGE http://genome.gsc.riken.jp/absolute/
• Resultados de 5' SAGE https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/ " https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/
• Etiquetas TEC RED vistas en wormbase https://web.archive.org/web/20080909025225/http://www.wormbase.org/db/searches/advanced/dumper