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Técnicas de ingeniería genética

Las técnicas de ingeniería genética permiten la modificación de los genomas de animales y plantas . Se han desarrollado técnicas para insertar, eliminar y modificar el ADN en mú...

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Las técnicas de ingeniería genética permiten la modificación de los genomas de animales y plantas . Se han desarrollado técnicas para insertar, eliminar y modificar el ADN en múltiples niveles, desde un par de bases específico en un gen concreto hasta genes completos. Existen varios pasos que se siguen antes de crear un organismo genéticamente modificado (OGM). Los ingenieros genéticos deben elegir primero el gen que desean insertar, modificar o eliminar. A continuación, el gen debe aislarse e incorporarse, junto con otros elementos genéticos, en un vector adecuado . Este vector se utiliza para insertar el gen en el genoma del huésped, creando así un organismo transgénico o editado.

La capacidad de modificar genéticamente organismos se basa en años de investigación y descubrimientos sobre la función y manipulación de los genes. Entre los avances más importantes se incluyen el descubrimiento de las enzimas de restricción , las ADN ligasas y el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación .

Los genes añadidos suelen ir acompañados de regiones promotoras y terminadoras , así como de un gen marcador seleccionable . El gen añadido puede modificarse para que se exprese de forma más eficiente. Este vector se inserta entonces en el genoma del organismo huésped. En animales, el gen se inserta normalmente en células madre embrionarias , mientras que en plantas puede insertarse en cualquier tejido que pueda cultivarse hasta convertirse en una planta completamente desarrollada.

Se realizan pruebas en el organismo modificado para asegurar la integración, herencia y expresión estables. La descendencia de primera generación es heterocigota , por lo que se requiere un cruzamiento para crear el patrón homocigoto necesario para una herencia estable. La homocigosidad debe confirmarse en los ejemplares de segunda generación.

Las técnicas iniciales insertaban los genes aleatoriamente en el genoma. Los avances permiten dirigir la inserción a ubicaciones específicas, lo que reduce los efectos secundarios no deseados. Estas técnicas se basaban en meganucleasas y nucleasas de dedos de zinc . Desde 2009, se han desarrollado sistemas más precisos y fáciles de implementar. Las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN) y el sistema Cas9-ARN guía (adaptado de CRISPR ) son los dos más comunes.

Historia

Numerosos descubrimientos y avances diferentes condujeron al desarrollo de la ingeniería genética . La manipulación genética dirigida por el ser humano comenzó con la domesticación de plantas y animales mediante selección artificial alrededor del año 12.000 a. C. [ 1 ] : 1 Se desarrollaron diversas técnicas para facilitar la cría y la selección. La hibridación fue una forma de introducir cambios rápidos en la composición genética de un organismo. La hibridación de cultivos probablemente ocurrió por primera vez cuando los humanos comenzaron a cultivar individuos genéticamente distintos de especies relacionadas en estrecha proximidad. [ 2 ] : 32 Algunas plantas pudieron propagarse mediante clonación vegetativa . [ 2 ] : 31

La herencia genética fue descubierta por primera vez por Gregor Mendel en 1865, tras experimentos de cruce de guisantes. [ 3 ] En 1928, Frederick Griffith demostró la existencia de un "principio transformador" involucrado en la herencia, que fue identificado como ADN en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty . Frederick Sanger desarrolló un método para secuenciar el ADN en 1977, lo que aumentó considerablemente la información genética disponible para los investigadores.

Tras descubrir la existencia y las propiedades del ADN , fue necesario desarrollar herramientas que permitieran manipularlo. En 1970, el laboratorio de Hamilton Smith descubrió las enzimas de restricción , lo que permitió a los científicos aislar genes del genoma de un organismo. [ 4 ] Las ADN ligasas , que unen el ADN roto, se descubrieron anteriormente, en 1967. [ 5 ] Al combinar ambas enzimas, fue posible "cortar y pegar" secuencias de ADN para crear ADN recombinante . Los plásmidos , descubiertos en 1952, [ 6 ] se convirtieron en herramientas importantes para transferir información entre células y replicar secuencias de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1983, permitió amplificar (replicar) pequeñas secciones de ADN y facilitó la identificación y el aislamiento de material genético.

Además de manipular el ADN, fue necesario desarrollar técnicas para su inserción en el genoma de un organismo. El experimento de Griffith ya había demostrado que algunas bacterias tenían la capacidad de captar y expresar ADN extraño de forma natural . La competencia artificial se indujo en Escherichia coli en 1970 mediante el tratamiento con una solución de cloruro de calcio (CaCl₂ ) . [ 7 ] La ​​transformación mediante electroporación se desarrolló a finales de la década de 1980, aumentando la eficiencia y el rango bacteriano. [ 8 ] En 1907 se descubrió una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens . A principios de la década de 1970 se descubrió que esta bacteria insertaba su ADN en las plantas mediante un plásmido Ti . [ 9 ] Al eliminar los genes del plásmido que causaban el tumor e incorporar nuevos genes, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciens y permitir que la bacteria insertara el ADN elegido en los genomas de las plantas. [ 10 ]

Selección de genes diana

El primer paso consiste en identificar el gen o los genes diana que se insertarán en el organismo huésped. Esto viene determinado por el objetivo que se busca obtener con el organismo resultante. En algunos casos, solo se ven afectados uno o dos genes. Para objetivos más complejos, pueden intervenir vías biosintéticas completas que involucren múltiples genes. Una vez encontrados, los genes y otra información genética de una amplia gama de organismos pueden insertarse en bacterias para su almacenamiento y modificación, creando así bacterias genéticamente modificadas . Las bacterias son económicas, fáciles de cultivar, clonales , se multiplican rápidamente, son relativamente fáciles de transformar y pueden almacenarse a -80  °C casi indefinidamente. Una vez aislado un gen, puede almacenarse dentro de la bacteria, lo que proporciona un suministro ilimitado para la investigación. [ 11 ]

Se pueden realizar análisis genéticos para determinar genes potenciales, seguidos de otras pruebas que identifican a los mejores candidatos. Un análisis sencillo consiste en mutar aleatoriamente el ADN con sustancias químicas o radiación y luego seleccionar aquellos que presentan el rasgo deseado. En organismos donde la mutación no es práctica, los científicos buscan individuos dentro de la población que presenten la característica mediante mutaciones naturales. Los procesos que analizan un fenotipo y luego intentan identificar el gen responsable se denominan genética directa . Posteriormente, es necesario mapear el gen comparando la herencia del fenotipo con marcadores genéticos conocidos . Los genes que están cerca uno del otro tienen más probabilidades de heredarse juntos. [ 12 ]

Otra opción es la genética inversa . Este enfoque consiste en dirigir una mutación a un gen específico y luego observar qué fenotipo se desarrolla. [ 12 ] La mutación puede diseñarse para inactivar el gen o permitir que se active solo bajo ciertas condiciones. Las mutaciones condicionales son útiles para identificar genes que normalmente son letales si no son funcionales. [ 13 ] Como los genes con funciones similares comparten secuencias similares ( homólogos ), es posible predecir la función probable de un gen comparando su secuencia con la de genes bien estudiados de organismos modelo . [ 12 ] El desarrollo de microarrays , transcriptomas y secuenciación del genoma ha facilitado mucho la búsqueda de genes deseables. [ 14 ]

La bacteria Bacillus thuringiensis fue descubierta por primera vez en 1901 como el agente causante de la muerte de los gusanos de seda . Debido a estas propiedades insecticidas, la bacteria se utilizó como insecticida biológico , desarrollado comercialmente en 1938. Las proteínas cry fueron descubiertas como responsables de la actividad insecticida en 1956, y para la década de 1980, los científicos habían clonado con éxito el gen que codifica esta proteína y lo expresaron en plantas. [ 15 ] El gen que proporciona resistencia al herbicida glifosato fue encontrado después de siete años de búsqueda en bacterias que vivían en la tubería de desagüe de una planta de fabricación de RoundUp de Monsanto . [ 16 ] En animales, la mayoría de los genes utilizados son genes de hormona del crecimiento . [ 17 ]

Manipulación genética

Todos los procesos de ingeniería genética implican la modificación del ADN. Tradicionalmente, el ADN se aislaba de las células de los organismos. Posteriormente, se comenzó a clonar genes a partir de un segmento de ADN tras la creación de una biblioteca de ADN o a sintetizarlos artificialmente . Una vez aislados, se añaden elementos genéticos adicionales al gen para permitir su expresión en el organismo huésped y facilitar la selección.

Extracción de células

Primero, la célula debe abrirse con cuidado , exponiendo el ADN sin dañarlo demasiado. Los métodos empleados varían según el tipo de célula. Una vez abierta, el ADN debe separarse de los demás componentes celulares. Una célula rota contiene proteínas y otros restos celulares. Al mezclar con fenol y/o cloroformo , seguido de centrifugación , los ácidos nucleicos pueden separarse de estos restos en una fase acuosa superior . Esta fase acuosa puede eliminarse y purificarse aún más, si es necesario, repitiendo los pasos con fenol-cloroformo. Los ácidos nucleicos pueden precipitarse de la solución acuosa utilizando etanol o isopropanol . Cualquier ARN puede eliminarse añadiendo una ribonucleasa que lo degrade. Muchas empresas venden ahora kits que simplifican el proceso. [ 18 ]

aislamiento genético

El gen que los investigadores buscan modificar (conocido como gen de interés) debe separarse del ADN extraído. Si se desconoce la secuencia, un método común es fragmentar el ADN mediante digestión aleatoria. Esto generalmente se logra utilizando enzimas de restricción (enzimas que cortan el ADN). Una digestión parcial con enzimas de restricción corta solo algunos de los sitios de restricción, lo que resulta en segmentos de ADN superpuestos. Los fragmentos de ADN se insertan en vectores plasmídicos individuales y se cultivan dentro de bacterias. Una vez dentro de la bacteria, el plásmido se copia a medida que la bacteria se divide . Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento en particular, se analiza la biblioteca de ADN en busca del fenotipo deseado . Si se detecta el fenotipo, es posible que la bacteria contenga el gen objetivo.

Si el gen no presenta un fenotipo detectable o la biblioteca de ADN no contiene el gen correcto, deben utilizarse otros métodos para aislarlo. Si la posición del gen puede determinarse mediante marcadores moleculares , el rastreo cromosómico es una forma de aislar el fragmento de ADN correcto. Si el gen expresa una homología cercana con un gen conocido en otra especie, podría aislarse buscando en la biblioteca genes que coincidan estrechamente con el gen conocido. [ 19 ]

Para secuencias de ADN conocidas, se pueden usar enzimas de restricción que cortan el ADN a ambos lados del gen. La electroforesis en gel luego clasifica los fragmentos según su longitud. [ 20 ] Algunos geles pueden separar secuencias que difieren en un solo par de bases . El ADN se puede visualizar tiñéndolo con bromuro de etidio y fotografiándolo bajo luz UV . Se puede colocar un marcador con fragmentos de longitudes conocidas junto al ADN para estimar el tamaño de cada banda. La banda de ADN del tamaño correcto debería contener el gen, donde se puede escindir del gel. [ 18 ] : 40–41 Otra técnica para aislar genes de secuencias conocidas implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [ 21 ] La PCR es una herramienta poderosa que puede amplificar una secuencia dada, que luego se puede aislar mediante electroforesis en gel. Su efectividad disminuye con genes más grandes y tiene el potencial de introducir errores en la secuencia.

Es posible sintetizar genes artificialmente . [ 22 ] Algunas secuencias sintéticas están disponibles comercialmente, evitando muchos de estos pasos iniciales. [ 23 ]

Modificación

El gen que se va a insertar debe combinarse con otros elementos genéticos para que funcione correctamente. En esta etapa, el gen puede modificarse para mejorar su expresión o eficacia. Además del gen que se va a insertar, la mayoría de los constructos contienen una región promotora y una región terminadora , así como un gen marcador seleccionable . La región promotora inicia la transcripción del gen y puede utilizarse para controlar la localización y el nivel de expresión génica, mientras que la región terminadora finaliza la transcripción. Un marcador seleccionable, que en la mayoría de los casos confiere resistencia a los antibióticos al organismo en el que se expresa, se utiliza para determinar qué células se transforman con el nuevo gen. Los constructos se elaboran mediante técnicas de ADN recombinante , como digestiones con enzimas de restricción , ligaciones y clonación molecular . [ 24 ]

Inserción de ADN en el genoma del huésped.

Una vez construido el gen, debe integrarse de forma estable en el genoma del organismo diana o existir como ADN extracromosómico . Existen diversas técnicas para insertar el gen en el genoma del huésped, las cuales varían según el tipo de organismo. En eucariotas multicelulares , si el transgén se incorpora a las células germinales del huésped , la célula resultante puede transmitirlo a su descendencia . Si el transgén se incorpora a las células somáticas , no puede heredarse. [ 25 ]

Transformación

La transformación bacteriana consiste en transferir un gen de una bacteria a otra. Este gen se integra en el plásmido de la bacteria receptora y, posteriormente, puede ser expresado por el nuevo huésped.

La transformación es la alteración directa de los componentes genéticos de una célula mediante el paso del material genético a través de la membrana celular . Alrededor del 1% de las bacterias son naturalmente capaces de incorporar ADN extraño , pero esta capacidad puede inducirse en otras bacterias. [ 26 ] Someter a las bacterias a estrés mediante un choque térmico o electroporación puede hacer que la membrana celular sea permeable al ADN, que luego puede incorporarse al genoma o existir como ADN extracromosómico. Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo cloruro de calcio ) en condiciones frías, antes de ser expuestas a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio altera parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante entre en la célula huésped. Se sugiere que exponer las células a cationes divalentes en condiciones frías puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor crea un desequilibrio térmico a través de la membrana celular, lo que fuerza al ADN a entrar en las células a través de los poros celulares o la pared celular dañada. La electroporación es otro método para promover la competencia. En este método, las células se someten a un breve choque eléctrico de 10-20 kV /cm, que se cree que crea poros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN plasmídico. Tras el choque eléctrico, los mecanismos de reparación de la membrana celular cierran rápidamente estos poros. El ADN incorporado puede integrarse en el genoma bacteriano o, más comúnmente, existir como ADN extracromosómico .

Una pistola genética utiliza la biobalística para insertar ADN en el tejido vegetal.
A. tumefaciens adhiriéndose a una célula de zanahoria

En las plantas, el ADN se inserta frecuentemente mediante recombinación mediada por Agrobacterium [ 27 ] , aprovechando la secuencia de ADN-T de Agrobacterium que permite la inserción natural de material genético en las células vegetales [ 28 ] . El tejido vegetal se corta en pequeños trozos y se sumerge en un fluido que contiene Agrobacterium en suspensión . Las bacterias se adhieren a muchas de las células vegetales expuestas por los cortes. Las bacterias utilizan la conjugación para transferir un segmento de ADN llamado ADN-T desde su plásmido a la planta. El ADN transferido es guiado al núcleo de la célula vegetal y se integra en el ADN genómico de la planta huésped. El ADN-T del plásmido se integra de forma semi-aleatoria en el genoma de la célula huésped [ 29 ] .

Al modificar el plásmido para expresar el gen de interés, los investigadores pueden insertar de forma estable el gen elegido en el genoma de las plantas. Las únicas partes esenciales del T-DNA son sus dos pequeñas repeticiones de borde (de 25 pares de bases), de las cuales al menos una es necesaria para la transformación de plantas. [ 30 ] [ 31 ] Los genes que se van a introducir en la planta se clonan en un vector de transformación vegetal que contiene la región T-DNA del plásmido . Un método alternativo es la agroinfiltración . [ 32 ] [ 33 ]

Otro método utilizado para transformar células vegetales es la biobalística , donde partículas de oro o tungsteno se recubren con ADN y luego se inyectan en células vegetales jóvenes o embriones vegetales. [ 34 ] Parte del material genético entra en las células y las transforma. Este método se puede utilizar en plantas que no son susceptibles a la infección por Agrobacterium y también permite la transformación de plastidios vegetales . Las células vegetales también se pueden transformar mediante electroporación, que utiliza una descarga eléctrica para hacer permeable la membrana celular al ADN plasmídico. Debido al daño causado a las células y al ADN, la eficiencia de transformación de la biobalística y la electroporación es menor que la transformación por Agrobacterium.

Transfección

La transformación tiene un significado diferente en relación con los animales, indicando la progresión a un estado canceroso, por lo que el proceso utilizado para insertar ADN extraño en células animales generalmente se llama transfección. [ 35 ] Hay muchas maneras de introducir ADN directamente en células animales in vitro . A menudo, estas células son células madre que se utilizan para la terapia génica . Los métodos basados ​​en químicos utilizan compuestos naturales o sintéticos para formar partículas que facilitan la transferencia de genes a las células. [ 36 ] Estos vectores sintéticos tienen la capacidad de unirse al ADN y acomodar grandes transferencias genéticas. [ 37 ] Uno de los métodos más simples consiste en utilizar fosfato de calcio para unir el ADN y luego exponerlo a células cultivadas. La solución, junto con el ADN, es encapsulada por las células. [ 38 ] Los liposomas y polímeros pueden utilizarse como vectores para administrar ADN a células animales cultivadas. Los liposomas con carga positiva se unen al ADN, mientras que los polímeros pueden diseñarse para interactuar con el ADN. [ 36 ] Forman lipoplejos y poliplejos respectivamente, que luego son absorbidos por las células. Otras técnicas incluyen el uso de electroporación y biolística. [ 39 ] En algunos casos, las células transfectadas pueden integrar de forma estable ADN externo en su propio genoma; este proceso se conoce como transfección estable . [ 40 ]

Para crear animales transgénicos, el ADN debe insertarse en embriones u óvulos viables. Esto generalmente se logra mediante microinyección , donde el ADN se inyecta a través de la envoltura nuclear de la célula directamente en el núcleo . [ 26 ] Los óvulos fertilizados superovulados se recolectan en la etapa de una sola célula y se cultivan in vitro . Cuando los pronúcleos de la cabeza del espermatozoide y del óvulo son visibles a través del protoplasma , el material genético se inyecta en uno de ellos. El ovocito se implanta luego en el oviducto de un animal pseudopreñado . [ 41 ] Otro método es la transferencia génica mediada por células madre embrionarias. El gen se transfecta en células madre embrionarias y luego se insertan en blastocistos de ratón que luego se implantan en madres nodrizas. La descendencia resultante es quimérica , y apareamientos posteriores pueden producir ratones completamente transgénicos con el gen de interés. [ 42 ]

Transducción

La transducción es el proceso por el cual un virus o vector viral introduce ADN extraño en una célula . [ 43 ] Los virus modificados genéticamente pueden usarse como vectores virales para transferir genes diana a otro organismo en la terapia génica . [ 44 ] Primero, se eliminan los genes virulentos del virus y se insertan los genes diana en su lugar. Las secuencias que permiten al virus insertar los genes en el organismo huésped deben permanecer intactas. Los vectores virales más comunes se desarrollan a partir de retrovirus o adenovirus . Otros virus utilizados como vectores incluyen lentivirus , poxvirus y herpesvirus . El tipo de virus utilizado dependerá de las células objetivo y de si el ADN se va a alterar de forma permanente o temporal.

Regeneración

Como a menudo solo una célula se transforma con material genético, el organismo debe regenerarse a partir de esa única célula. En las plantas, esto se logra mediante el uso de cultivo de tejidos . [ 45 ] [ 46 ] Cada especie de planta tiene diferentes requisitos para una regeneración exitosa. Si tiene éxito, la técnica produce una planta adulta que contiene el transgén en cada célula. [ 47 ] En los animales es necesario asegurar que el ADN insertado esté presente en las células madre embrionarias . [ 27 ] La descendencia puede ser examinada para el gen. Toda la descendencia de la primera generación es heterocigota para el gen insertado y debe ser endogámica para producir un espécimen homocigoto . Las bacterias consisten en una sola célula y se reproducen clonalmente, por lo que la regeneración no es necesaria. Se utilizan marcadores seleccionables para diferenciar fácilmente las células transformadas de las no transformadas.

Las células que han sido transformadas con éxito mediante el ADN contienen el gen marcador, mientras que las que no lo han sido carecen de él. Al cultivar las células en presencia de un antibiótico o una sustancia química que seleccione o marque las células que expresan dicho gen, es posible separar las células modificadas de las no modificadas. Otro método de cribado consiste en una sonda de ADN que se adhiere únicamente al gen insertado. Estos marcadores suelen estar presentes en el organismo transgénico, aunque se han desarrollado diversas estrategias para eliminar el marcador seleccionable de la planta transgénica madura. [ 48 ]

Confirmación

El hecho de que un organismo recombinante contenga los genes insertados no suele ser suficiente para asegurar que se expresen adecuadamente en los tejidos previstos. Se realizan pruebas adicionales mediante PCR, hibridación Southern y secuenciación de ADN para confirmar que un organismo contiene el nuevo gen. [ 49 ] Estas pruebas también pueden confirmar la ubicación cromosómica y el número de copias del gen insertado. Una vez confirmado, también se utilizan métodos que buscan y miden los productos génicos (ARN y proteína) para evaluar la expresión génica, la transcripción, los patrones de procesamiento del ARN y la expresión y localización de los productos proteicos. Estos incluyen hibridación Northern , RT-PCR cuantitativa , Western blot , inmunofluorescencia , ELISA y análisis fenotípico. [ 50 ] Cuando procede, se estudia la descendencia del organismo para confirmar que el transgén y el fenotipo asociado se heredan de forma estable.

Inserción direccional de genes

Los métodos tradicionales de ingeniería genética generalmente insertan el nuevo material genético de forma aleatoria dentro del genoma del huésped. Esto puede afectar o alterar otros genes dentro del organismo. Se desarrollaron métodos que insertaban el nuevo material genético en sitios específicos dentro del genoma de un organismo. Los primeros métodos que dirigían genes a sitios específicos dentro de un genoma se basaban en la recombinación homóloga (RH). [ 51 ] Al crear construcciones de ADN que contienen una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de RH dentro de la célula inserten la construcción en la ubicación deseada. El uso de este método en células madre embrionarias condujo al desarrollo de ratones transgénicos con genes inactivados . También ha sido posible insertar genes o alterar los patrones de expresión génica . [ 52 ]

Si se inactiva un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes, se utilizaron recombinasas específicas de sitio (SSR). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-LoxP y Flp-FRT . La recombinasa Cre es una enzima que elimina ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de manera similar, con la recombinasa Flip reconociendo secuencias FRT. Al cruzar un organismo que contiene los sitios de recombinasa que flanquean el gen de interés con un organismo que expresa la SSR bajo el control de promotores específicos de tejido , es posible inactivar o activar genes solo en ciertas células. Esto también se ha utilizado para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Modificaciones posteriores de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación solo bajo ciertas condiciones, lo que permitió inactivar o expresar genes en momentos o etapas de desarrollo deseados . [ 52 ]

La edición genómica utiliza nucleasas diseñadas artificialmente que crean rupturas específicas de doble cadena en ubicaciones deseadas del genoma. Estas rupturas están sujetas a procesos de reparación del ADN celular que pueden aprovecharse para la inactivación, corrección o inserción dirigida de genes con alta frecuencia. Si se dispone de un ADN donante que contenga la secuencia apropiada (homologías), el nuevo material genético que contiene el transgén se integrará en el sitio objetivo con alta eficiencia mediante recombinación homóloga . [ 53 ] Hay cuatro familias de nucleasas modificadas: meganucleasas , [ 54 ] [ 55 ] ZFN , [ 56 ] [ 57 ] nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN), [ 58 ] [ 59 ] el CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas espaciadas regularmente agrupadas/proteína asociada a CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas9) . [ 60 ] [ 61 ] Entre los cuatro tipos, TALEN y CRISPR/Cas son los dos más utilizados. [ 62 ] Los avances recientes han considerado combinar múltiples sistemas para explotar las mejores características de ambos (por ejemplo, megaTAL que son una fusión de un dominio de unión al ADN TALE y una meganucleasa). [ 63 ] La investigación reciente también se ha centrado en desarrollar estrategias para crear la eliminación o corrección de genes sin crear roturas de doble cadena (editores de bases). [ 62 ]

Meganucleasas y nucleasas de dedos de zinc

Las meganucleasas se utilizaron por primera vez en 1988 en células de mamíferos. [ 64 ] Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas que funcionan como enzimas de restricción con sitios de reconocimiento largos, lo que las hace más específicas para su sitio objetivo que otras enzimas de restricción . Esto aumenta su especificidad y reduce su toxicidad, ya que no se dirigen a tantos sitios dentro de un genoma. Las meganucleasas más estudiadas son las de la familia LAGLIDADG . Si bien las meganucleasas aún son bastante susceptibles a la unión fuera del objetivo, lo que las hace menos atractivas que otras herramientas de edición genética, su menor tamaño las hace atractivas, particularmente para perspectivas de vectorización viral. [ 65 ] [ 53 ]

Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), utilizadas por primera vez en 1996, se crean típicamente mediante la fusión de dominios de dedos de zinc y el dominio de la nucleasa Fok I. Por lo tanto, las ZFN tienen la capacidad de cortar el ADN en sitios específicos. [ 53 ] Al diseñar el dominio de dedos de zinc para que se dirija a un sitio específico dentro del genoma, es posible editar la secuencia genómica en la ubicación deseada . [ 65 ] [ 66 ] [ 53 ] Las ZFN tienen una mayor especificidad, pero aún conservan el potencial de unirse a secuencias no específicas. Si bien una cierta cantidad de corte fuera del objetivo es aceptable para crear organismos modelo transgénicos, podrían no ser óptimas para todos los tratamientos de terapia génica humana. [ 65 ]

TALEN y CRISPR

El acceso al código que rige el reconocimiento del ADN por efectores tipo activador de la transcripción (TALE) en 2009 abrió el camino al desarrollo de una nueva clase de herramientas eficientes de edición genética basadas en TAL. Las proteínas TALE, secretadas por el patógeno vegetal Xanthomonas, se unen con gran especificidad a genes dentro de la planta huésped e inician la transcripción de los genes que ayudan a la infección. La ingeniería de TALE mediante la fusión del núcleo de unión al ADN con el dominio catalítico de la nucleasa Fok I permitió la creación de una nueva herramienta de nucleasas de diseño, la nucleasa TALE (TALEN). [ 67 ] Tienen una de las mayores especificidades de todas las nucleasas diseñadas actualmente. Debido a la presencia de secuencias repetidas, son difíciles de construir mediante procedimientos estándar de biología molecular y dependen de métodos más complejos como la clonación Golden Gate . [ 62 ]

En 2011, se desarrolló otra importante tecnología innovadora basada en los sistemas CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente / proteína asociada a CRISPR), que funcionan como un sistema inmunitario adaptativo en bacterias y arqueas . El sistema CRISPR/Cas permite a las bacterias y arqueas combatir los virus invasores cortando el ADN viral e insertando fragmentos de este en su propio genoma. El organismo transcribe este ADN a ARN y lo combina con proteínas Cas9 para producir rupturas de doble cadena en el ADN viral invasor. El ARN guía dirige la enzima Cas9 al lugar correcto en el ADN del virus. Al combinar las proteínas Cas con un ARN guía diseñado, CRISPR/Cas9 puede utilizarse para inducir rupturas de doble cadena en puntos específicos de las secuencias de ADN. Estas rupturas son reparadas por enzimas celulares de reparación del ADN, lo que en la mayoría de los casos genera una pequeña mutación de inserción/deleción. La reparación dirigida del ADN es posible proporcionando una plantilla de ADN donante que representa el cambio deseado y que (a veces) se utiliza para la reparación de roturas de doble cadena mediante recombinación homóloga. Posteriormente se demostró que CRISPR/Cas9 puede editar células humanas en una placa de cultivo. Aunque la primera generación carece de la especificidad de TALEN, la principal ventaja de esta tecnología es la simplicidad de su diseño. También permite dirigir la edición a múltiples sitios simultáneamente, lo que posibilita la edición de varios genes a la vez. CRISPR/Cpf1 es un sistema descubierto más recientemente que requiere un ARN guía diferente para crear roturas de doble cadena específicas (deja extremos salientes al cortar el ADN) en comparación con CRISPR/Cas9. [ 62 ]

CRISPR/Cas9 es eficiente en la interrupción genética. La creación de bebés resistentes al VIH por el investigador chino He Jiankui es quizás el ejemplo más famoso de interrupción genética mediante este método. [ 68 ] Es mucho menos eficaz en la corrección genética. Se están desarrollando métodos de edición de bases en los que se utiliza una endonucleasa Cas 9 "inactiva" o una enzima relacionada para la focalización genética, mientras que una enzima desaminasa unida realiza un cambio de base específico en el ADN. [ 69 ] El perfeccionamiento más reciente de CRISPR-Cas9 se denomina Edición Primaria. Este método une una transcriptasa inversa a una nucleasa modificada guiada por ARN que solo realiza cortes de cadena simple, pero no roturas de doble cadena. Reemplaza la porción de ADN adyacente al corte mediante la acción sucesiva de la nucleasa y la transcriptasa inversa, introduciendo el cambio deseado a partir de una plantilla de ARN. [ 70 ]

Véase también

Referencias

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