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Articulo de referencia

Ensayo de desplazamiento térmico

Un ensayo de desplazamiento térmico ( TSA ) mide la estabilidad de una proteína mediante el cambio en su temperatura de desnaturalización térmica . Esto se realiza bajo diversas...

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Un ensayo de desplazamiento térmico ( TSA ) mide la estabilidad de una proteína mediante el cambio en su temperatura de desnaturalización térmica . Esto se realiza bajo diversas condiciones, como variaciones en la concentración del fármaco, la formulación del tampón ( pH o fuerza iónica ), el potencial redox o la mutación de la secuencia . El método más común para medir los desplazamientos térmicos de las proteínas es la fluorimetría diferencial de barrido (DSF). La metodología DSF incluye técnicas como nanoDSF , [ 1 ] [ 2 ] que se basa en la fluorescencia intrínseca de los residuos nativos de triptófano o tirosina , y Thermofluor, que utiliza colorantes fluorogénicos extrínsecos. [ 3 ]

La unión de ligandos de bajo peso molecular puede aumentar la estabilidad térmica de una proteína, como describieron Daniel Koshland (1958) [ 4 ] y Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang y Schellman (1959). [ 5 ] Casi la mitad de las enzimas requieren un cofactor de iones metálicos . [ 6 ] Las proteínas termoestables suelen ser más útiles que sus contrapartes no termoestables, por ejemplo, la ADN polimerasa en la reacción en cadena de la polimerasa , [ 7 ] por lo que la ingeniería de proteínas a menudo incluye la adición de mutaciones para aumentar la estabilidad térmica. La cristalización de proteínas es más exitosa para proteínas con un punto de fusión más alto [ 8 ] y la adición de componentes de tampón que estabilizan las proteínas mejora la probabilidad de que se formen cristales de proteínas. [ 9 ] Si se examina el pH, se deben tener en cuenta los posibles efectos de la molécula de tampón sobre la estabilidad térmica junto con el hecho de que el pKa de cada molécula de tampón cambia de forma única con la temperatura. [ 10 ] Además, siempre que se examine una especie cargada , se deben tener en cuenta los efectos del contraión .

La estabilidad térmica de las proteínas se ha investigado tradicionalmente mediante ensayos bioquímicos , dicroísmo circular o calorimetría diferencial de barrido . Los ensayos bioquímicos requieren la actividad catalítica de la proteína en cuestión, así como un ensayo específico. Tanto el dicroísmo circular como la calorimetría diferencial de barrido consumen grandes cantidades de proteína y son métodos de bajo rendimiento. El ensayo Thermofluor fue el primer ensayo de desplazamiento térmico de alto rendimiento, y su utilidad y limitaciones han impulsado la invención de una gran cantidad de métodos alternativos. Cada método tiene sus ventajas y desventajas, pero todos presentan dificultades con proteínas intrínsecamente desordenadas sin una estructura terciaria claramente definida , ya que la esencia de un ensayo de desplazamiento térmico es medir la temperatura a la que una proteína pasa de una estructura bien definida a un estado desordenado.

Métodos

nanoDSF

La fluorimetría de barrido diferencial a nanoescala, o nanoDSF , es una técnica de caracterización biofísica utilizada para evaluar la estabilidad conformacional de una muestra biológica, típicamente una proteína. [ 2 ] Las muestras se someten a rampas de temperatura o gradientes de desnaturalizante químico, y la fluorescencia intrínseca se mide y ajusta para determinar el punto de fusión ( T m ). Las aplicaciones incluyen la clasificación de formulaciones, la ingeniería de proteínas (comparación de mutantes con el tipo silvestre ) y la unión de ligandos (cuantificación de constantes de afinidad). Un requisito previo de la técnica es que la proteína debe contener un residuo intrínsecamente fluorescente, típicamente triptófano o tirosina. Los beneficios incluyen análisis sin marcadores, evitación de fluoróforos extrínsecos , bajo consumo de muestra, facilidad de uso, facilidad de automatización y alto rendimiento de cribado. Los inconvenientes incluyen una propensión a falsos positivos y negativos, lo que generalmente requiere un cribado de seguimiento con una técnica ortogonal potencialmente de menor rendimiento para confirmar. Los instrumentos comerciales actuales emplean capilares patentados [ 11 ] [ 12 ] o placas genéricas de alto rendimiento de 384 pocillos [ 13 ] para el análisis de muestras.

Termofluor

Diagrama

La técnica fue descrita por primera vez por Semisotnov et al. (1991) [ 14 ] utilizando 1,8-ANS y cubetas de cuarzo. 3 Dimensional Pharmaceuticals fue la primera en describir una versión de alto rendimiento utilizando un lector de placas [ 15 ] y Wyeth Research publicó una variación del método con SYPRO Orange en lugar de 1,8-ANS. [ 16 ] SYPRO Orange tiene un perfil de longitud de onda de excitación/emisión compatible con las máquinas de qPCR que son casi omnipresentes en las instituciones que realizan investigación en biología molecular. El nombre fluorimetría de barrido diferencial (DSF) se introdujo más tarde [ 17 ] pero Thermofluor es preferible ya que Thermofluor ya no es una marca registrada y la fluorimetría de barrido diferencial se confunde fácilmente con la calorimetría de barrido diferencial.

SYPRO Orange se une de forma no específica a superficies hidrofóbicas, y el agua atenúa fuertemente su fluorescencia. Cuando la proteína se despliega, las superficies hidrofóbicas expuestas se unen al colorante, lo que produce un aumento de la fluorescencia al excluir el agua. Las micelas de detergente también se unen al colorante y aumentan drásticamente el ruido de fondo. Este efecto se reduce al cambiar al colorante ANS; [ 18 ] sin embargo, este reactivo requiere excitación UV. La curva de estabilidad y su valor de punto medio (temperatura de fusión, T m también conocida como temperatura de exposición hidrofóbica, T h ) se obtienen aumentando gradualmente la temperatura para desplegar la proteína y midiendo la fluorescencia en cada punto. Las curvas se miden para la proteína sola y para la proteína + ligando, y se calcula Δ T m . El método puede no funcionar muy bien para interacciones proteína-proteína si uno de los socios de interacción contiene grandes parches hidrofóbicos, ya que es difícil analizar la prevención de la agregación, la estabilización de los pliegues nativos y el impedimento estérico del acceso del colorante a los sitios hidrofóbicos. Además, la agregación parcial de proteínas también puede limitar el aumento relativo de fluorescencia al calentarse; en casos extremos, no habrá ningún aumento de fluorescencia, ya que toda la proteína ya se encuentra agregada antes del calentamiento. Conocer este efecto puede ser muy útil, puesto que un elevado aumento relativo de fluorescencia sugiere una fracción significativa de proteína plegada en el material de partida.

Este ensayo permite la detección de alto rendimiento de ligandos para la proteína objetivo y se utiliza ampliamente en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos en la industria farmacéutica, en proyectos de genómica estructural y en la ingeniería de proteínas de alto rendimiento.

Un ensayo típico

  1. Materiales: Un fluorímetro equipado con control de temperatura o instrumentación similar (máquinas de qPCR); un colorante fluorescente adecuado; una placa de ensayo adecuada, como una placa de qPCR de 96 pocillos .
  2. Soluciones compuestas: Los ligandos de prueba se preparan en una solución concentrada entre 50 y 100 veces, generalmente en el rango de 10 a 100 mM. Para la titulación, un protocolo experimental típico emplea un conjunto de 12 pocillos, que comprenden 11 concentraciones diferentes de un compuesto de prueba con un único pocillo de control negativo.
  3. Solución proteica: Normalmente, la proteína objetivo se diluye a partir de una solución madre concentrada hasta alcanzar una concentración de trabajo de aproximadamente 0,5–5 μM de proteína con colorante en un tampón de ensayo adecuado. Las concentraciones exactas de proteína y colorante se definen mediante estudios experimentales de desarrollo del ensayo.
  4. Centrifugación y dispensación de aceite: Centrifugación breve (~1000 × g, 1 min) de la placa de ensayo para mezclar los compuestos con la solución proteica, se añaden 1–2 μL de aceite de silicona para evitar la evaporación durante el calentamiento sobre la solución (algunos sistemas utilizan sellos de plástico en su lugar), seguido de una centrifugación adicional (~1000 × g, 1 min).
  5. Configuración instrumental: Las velocidades típicas de rampa de temperatura oscilan entre 0,1 y 10  °C/min, pero generalmente se encuentran en el rango de 1  °C/min. La fluorescencia en cada pocillo se mide a intervalos regulares, de 0,2 a 1  °C/imagen, en un rango de temperatura que abarca las temperaturas típicas de desnaturalización de proteínas de 25 a 95  °C. [ 19 ]

CPM, colorantes específicos para tioles

Alexandrov et al. (2008) [ 20 ] publicaron una variación del ensayo Thermofluor donde SYPRO Orange fue reemplazado por N -[4-(7-dietilamino-4-metil-3-cumarinil)fenil]maleimida (CPM), un compuesto que solo fluoresce después de reaccionar con un nucleófilo . El CPM tiene una alta preferencia por los tioles sobre otros nucleófilos biológicos típicos y, por lo tanto, reaccionará con las cadenas laterales de cisteína antes que con otras. Las cisteínas suelen estar enterradas en el interior de una proteína plegada, ya que son hidrofóbicas. Cuando una proteína se desnaturaliza, los tioles de cisteína se vuelven disponibles y se puede leer una señal fluorescente del CPM que reaccionó. Las longitudes de onda de excitación y emisión para el CPM que reaccionó son 387  nm/ 463  nm, por lo que se requiere un lector de placas de fluorescencia o una máquina de qPCR con filtros especializados. Alexandrov et al. La técnica se utilizó con éxito en las proteínas de membrana Apelin GPCR y FAAH , así como en la β-lactoglobina, que se fibrila al calentarse en lugar de convertirse en un glóbulo fundido .

DSF-GTP

La técnica DSF-GTP (GFP-Tagged Protein-of-Interest) fue desarrollada por un equipo liderado por Patrick Schaeffer en la Universidad James Cook y publicada en Moreau et al. 2012. [ 21 ] El desarrollo de la fluorimetría de barrido diferencial y la capacidad de alto rendimiento de Thermofluor han facilitado enormemente el cribado de las condiciones de cristalización de proteínas y grandes bibliotecas de mutantes en programas de genómica estructural, así como de ligandos en programas de descubrimiento de fármacos y genómica funcional . Estas técnicas están limitadas por su requisito de proteínas altamente purificadas y colorantes solvatocrómicos , lo que impulsa la necesidad de tecnologías de alto rendimiento más robustas que puedan utilizarse con muestras de proteínas crudas. Esta necesidad se satisfizo con el desarrollo de una nueva tecnología de alto rendimiento para la determinación cuantitativa de la estabilidad de proteínas y la unión de ligandos mediante fluorimetría de barrido diferencial de proteínas marcadas con proteína verde fluorescente (GFP). Esta tecnología se basa en el principio de que un cambio en el entorno proximal de la GFP, como el desplegamiento y la agregación de la proteína de interés, es medible a través de su efecto en la fluorescencia del fluoróforo. La tecnología es simple, rápida e insensible a las variaciones en los volúmenes de muestra, y el rango útil de temperatura y pH es de 30–80  °C y 5–11 respectivamente. El sistema no requiere colorantes solvatocrómicos, lo que reduce el riesgo de interferencias. Las muestras de proteína se mezclan simplemente con las condiciones de prueba en una placa de 96 pocillos y se someten a un protocolo de curva de fusión utilizando un termociclador en tiempo real. Los datos se obtienen en 1–2 h e incluyen medidas de control de calidad únicas a través de la señal de GFP. DSF-GTP se ha aplicado para la caracterización de proteínas y el cribado de compuestos pequeños. [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]

DCVJ, colorantes sensibles a la rigidez

La 4-(diciano-vinil)julolidina (DCVJ) es una sonda molecular de rotor cuya fluorescencia depende en gran medida de la rigidez de su entorno. Cuando la proteína se desnaturaliza, la fluorescencia de la DCVJ aumenta. Se ha informado que funciona con 40  mg/ml de anticuerpo. [ 27 ]

Tiempo de vida de la fluorescencia intrínseca del triptófano

La vida media de la fluorescencia del triptófano difiere entre la proteína plegada y la desplegada. La cuantificación de las vidas medias de fluorescencia excitadas por UV a diferentes intervalos de temperatura proporciona una medición de T m . Una ventaja importante de esta técnica es que no es necesario añadir colorantes reporteros, ya que el triptófano es un componente intrínseco de la proteína. Esto también puede ser una desventaja, ya que no todas las proteínas contienen triptófano. La vida media de fluorescencia intrínseca funciona con proteínas de membrana y micelas de detergente, pero un fluoróforo UV potente (por ejemplo, una molécula pequeña autofluorescente) en el tampón podría enmascarar la señal.

Longitud de onda de fluorescencia intrínseca del triptófano

La utilización de las propiedades de fluorescencia intrínsecas de los residuos de triptófano en muchas proteínas constituye la base de la nanoDSF. Las longitudes de onda de emisión de los residuos de triptófano dependen del entorno químico circundante, especialmente de la solvatación (véase solvatocromismo ) y, por lo tanto, difieren entre la proteína plegada y la desplegada, al igual que ocurre con el tiempo de vida de la fluorescencia. Típicamente, los residuos de triptófano internos en un entorno más hidrofóbico exhiben un notable desplazamiento al rojo de la emisión, de aproximadamente 330  nm a 350  nm, tras el despliegue de la proteína y su exposición al agua. La cuantificación de los desplazamientos de la longitud de onda de fluorescencia en varios intervalos de temperatura proporciona una medición de T m . Actualmente existen al menos tres instrumentos en el mercado que pueden leer este desplazamiento de longitud de onda de forma de alto rendimiento mientras se calientan las muestras. [ 13 ] [ 11 ] [ 12 ] Las ventajas y desventajas son las mismas que para el tiempo de vida de la fluorescencia, excepto que existen más ejemplos de uso en la literatura científica . [ 2 ] nanoDSF utiliza la fluorescencia intrínseca de los residuos de triptófano presentes en muchas proteínas para monitorizar el plegamiento y la estabilidad de las proteínas. Dado que la fluorescencia del triptófano depende del entorno químico local, el desplegamiento de la proteína expone los residuos enterrados al agua y, por lo general, desplaza el máximo de emisión de aproximadamente 330 nm a 350 nm. [ 28 ]

Dispersión de luz estática

La dispersión de luz estática permite monitorizar el tamaño de las especies en solución. Dado que las proteínas suelen agregarse al desnaturalizarse (o formar fibrillas), el tamaño de las especies detectadas aumentará.

Este método no requiere marcadores y es independiente de residuos específicos en la proteína o la composición del tampón. El único requisito es que la proteína se agregue o fibrile tras la desnaturalización y que la proteína de interés haya sido purificada.

Pago rápido

En la proteólisis paralela rápida, el investigador añade una proteasa termoestable ( termolisina ) y toma muestras en paralelo al calentarlas en un termociclador de gradiente térmico. [ 29 ] Opcionalmente, por ejemplo, para proteínas expresadas a niveles bajos, se realiza un Western blot para determinar a qué temperatura se degrada una proteína. Para proteínas puras o altamente enriquecidas, es posible la detección directa mediante SDS-PAGE, lo que facilita la cuantificación directa basada en la fluorescencia de Commassie. FastPP aprovecha que las proteínas se vuelven cada vez más susceptibles a la proteólisis cuando se despliegan y que la termolisina escinde en residuos hidrofóbicos que se encuentran típicamente en el núcleo de las proteínas.

Para reducir la carga de trabajo, las transferencias Western podrían sustituirse por la tinción con etiquetas de polihistidina en gel SDS-PAGE , siempre que la proteína disponga de dicha etiqueta y se exprese en cantidades adecuadas.

FastPP puede utilizarse en mezclas complejas de proteínas sin purificar y en proteínas fusionadas con otras proteínas, como GST o GFP , siempre que la secuencia diana del Western blot (por ejemplo, la etiqueta His ) esté directamente unida a la proteína de interés. Sin embargo, la termolisina disponible comercialmente depende de iones de calcio para su actividad y se desnaturaliza a temperaturas superiores a 85 °C. Por lo tanto, es imprescindible la presencia de calcio y la ausencia de quelantes de calcio en el tampón; otros compuestos que interfieren con la función de la proteasa (como altas concentraciones de detergentes) también podrían resultar problemáticos.

FASTpp también se ha utilizado para monitorizar el plegamiento acoplado a la unión de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP).

CETSA

El ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA® ) [ 30 ] es una técnica biofísica aplicable tanto a células vivas como a biopsias de tejido. CETSA® se basa en el descubrimiento de que las curvas de fusión de proteínas también pueden generarse en células intactas y que la unión de fármacos produce una estabilización térmica muy significativa de las proteínas. Tras la desnaturalización, las proteínas se agregan y, por lo tanto, pueden eliminarse mediante centrifugación después de la lisis celular. Las proteínas estables que se encuentran en el sobrenadante pueden detectarse, por ejemplo, mediante Western blot, alfa-LISA o espectrometría de masas. La técnica CETSA® es muy rigurosa, reproducible y no es propensa a falsos positivos. Sin embargo, es posible que una muestra, o un compuesto de molécula pequeña, se una a una proteína en la vía de señalización de una diana determinada. Si esa proteína induce una mayor estabilización de la proteína diana original a través de una cascada de eventos, podría manifestarse como una interacción directa con la diana. Una ventaja de este método es que no requiere marcadores y, por lo tanto, es aplicable a estudios de unión de fármacos en una amplia gama de células y tejidos. CETSA® también puede realizarse en lisados ​​celulares en comparación con células intactas, lo que ayuda a determinar la penetración de la muestra en la membrana celular.

TermoFAD

Variante de Thermofluor específica para proteínas de unión a flavina. De forma análoga a los ensayos de unión de Thermofluor, se calienta un pequeño volumen de solución proteica y se monitoriza el aumento de fluorescencia en función de la temperatura. A diferencia de Thermofluor, no se necesita un colorante fluorescente externo porque el cofactor de flavina ya está presente en la proteína de unión a flavina y sus propiedades de fluorescencia cambian al desplegarse. [ 31 ]

SEC-TS

La cromatografía de exclusión por tamaño se puede utilizar directamente para evaluar la estabilidad de las proteínas en presencia o ausencia de ligandos. [ 32 ] Las muestras de proteína purificada se calientan en un baño de agua o termociclador , se enfrían, se centrifugan para eliminar las proteínas agregadas y se analizan mediante HPLC analítica . A medida que se alcanza la temperatura de fusión y la proteína precipita o se agrega, la altura del pico disminuye y la altura del pico de exclusión aumenta. Esto se puede utilizar para identificar ligandos e inhibidores y optimizar las condiciones de purificación. [ 33 ] [ 34 ]

Si bien su rendimiento es menor que el de FSEC-TS, al requerir grandes cantidades de proteína purificada, SEC-TS evita cualquier influencia de la etiqueta fluorescente en la estabilidad aparente de la proteína.

FSEC-TS

En la cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia, la proteína de interés se marca fluorescentemente (por ejemplo, con GFP ) y se hace pasar a través de una columna de filtración en gel en un sistema FPLC equipado con un detector de fluorescencia. El cromatograma resultante permite al investigador estimar la dispersión y el nivel de expresión de la proteína marcada en el tampón actual. [ 35 ] Dado que solo se mide la fluorescencia, solo la proteína marcada se ve en el cromatograma. La FSEC se utiliza normalmente para comparar ortólogos de proteínas de membrana o para evaluar detergentes para solubilizar proteínas de membrana específicas.

Para el ensayo de termoestabilidad basado en cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia (FSEC-TS), las muestras se calientan de la misma manera que en FastPP y CETSA y, tras la centrifugación para eliminar el precipitado, el sobrenadante se trata de la misma manera que en FSEC. [ 36 ] Se observan agregados más grandes en el volumen muerto, mientras que la altura del pico de la proteína de interés disminuye cuando se alcanza la temperatura de desnaturalización.

La GFP tiene una T m de ~76  °C, por lo que la técnica está limitada a temperaturas inferiores a ~70  °C. [ 36 ]

Ensayo de termoestabilidad de unión de radioligandos

Los GPCR son proteínas transmembrana farmacológicamente importantes . Sus estructuras cristalinas por difracción de rayos X se revelaron mucho después que las de otras proteínas transmembrana de menor interés. La dificultad para obtener cristales de proteínas de GPCR probablemente se debió a su alta flexibilidad. Se obtuvieron versiones menos flexibles mediante la truncación, mutación e inserción de lisozima T4 en la secuencia recombinante. Uno de los métodos que los investigadores utilizaron para guiar estas alteraciones fue el ensayo de termoestabilidad de unión de radioligandos. [ 37 ]

El ensayo se realiza incubando la proteína con un ligando radiomarcado durante 30 minutos a una temperatura determinada, luego se enfría en hielo, se pasa a través de una minicolumna de filtración en gel y se cuantifican los niveles de radiación de la proteína que sale de la columna. La concentración del radioligando es lo suficientemente alta como para saturar la proteína. La proteína desnaturalizada no puede unirse al radioligando, y la proteína y el radioligando se separarán en la minicolumna de filtración en gel. Al analizar mutantes, la selección se basará en la estabilidad térmica en la conformación específica; es decir, si el radioligando es un agonista, la selección se basará en la conformación de unión del agonista, y si es un antagonista, la selección se basará en la estabilidad en la conformación de unión del antagonista.

Los radioinmunoensayos tienen la ventaja de trabajar con cantidades mínimas de proteína. Sin embargo, implican el uso de sustancias radiactivas y una gran cantidad de trabajo manual. Es necesario conocer un ligando de alta afinidad para la proteína de interés y el tampón no debe interferir con la unión del radioligando. Otros ensayos de desplazamiento térmico también permiten seleccionar conformaciones específicas si se añade un ligando del tipo adecuado al experimento.

Comparación de los distintos enfoques

Aplicaciones

Detección de drogas sin etiquetas

Thermofluor se ha utilizado ampliamente en campañas de cribado de fármacos. [ 15 ] [ 38 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 16 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 10 ] Debido a que Thermofluor detecta sitios de unión de alta afinidad para moléculas pequeñas en proteínas, puede encontrar compuestos que se unen a subsitios del sitio activo, sitios de cofactores o sitios de unión alostéricos con igual eficacia. El método generalmente requiere el uso de concentraciones de compuestos de cribado a >10x el umbral de unión deseado. Establecer 5 μM como un umbral de éxito razonable requiere, en consecuencia, una concentración de ligando de prueba de 50 a 100 μM en el pocillo de muestra. Para la mayoría de las bibliotecas de compuestos de fármacos, donde muchos compuestos no son solubles más allá de ~100 μM, el cribado de múltiples compuestos no es factible debido a problemas de solubilidad. Las pruebas de termofluorescencia no requieren el desarrollo de reactivos de cribado personalizados (por ejemplo, análogos de sustratos escindibles), no requieren reactivos radiactivos y, en general, son menos sensibles a los efectos de los compuestos que reaccionan químicamente con los residuos del sitio activo de las proteínas y que, en consecuencia, aparecen como resultados indeseables en las pruebas de actividad enzimática.

Optimización de fármacos candidatos

Las mediciones de termofluorescencia de T m pueden relacionarse cuantitativamente con los valores de K d del fármaco , [ 42 ] aunque esto requiere mediciones calorimétricas adicionales de la entalpía de desnaturalización de las proteínas diana, determinadas mediante DSC. El rango dinámico del ensayo de termofluorescencia es muy amplio, por lo que el mismo ensayo puede utilizarse para encontrar compuestos activos micromolares y para optimizar compuestos principales subnanomolares, lo que hace que el método sea particularmente útil en el desarrollo de relaciones QSAR para la optimización de compuestos principales.

Estudios del mecanismo enzimático

Muchas proteínas requieren la unión simultánea o secuencial de múltiples sustratos, cofactores y/o efectores alostéricos. Los estudios de termofluorescencia de moléculas que se unen a subsitios del sitio activo, sitios de cofactores o sitios de unión alostéricos pueden ayudar a dilucidar características específicas del mecanismo enzimático que pueden ser importantes para el diseño de campañas de cribado de fármacos eficaces [ 43 ] y para la caracterización de nuevos mecanismos de inhibición. [ 44 ]

Estabilización de proteínas para un aislamiento optimizado

Se pueden realizar preanálisis por termofluorescencia que abarcan un amplio rango de pH, fuerza iónica y aditivos como iones metálicos y cofactores. La generación de una superficie de respuesta de proteínas es útil para establecer las condiciones óptimas del ensayo y, con frecuencia, puede conducir a un esquema de purificación mejorado, según sea necesario para respaldar las campañas de cribado de alto rendimiento (HTS) y los estudios biofísicos. [ 17 ] [ 45 ]

Caracterización de proteínas modificadas genéticamente

Muchas aplicaciones de la ingeniería de proteínas para el descubrimiento de fármacos o aplicaciones biofísicas implican la modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante truncamiento, fusiones de dominios, modificaciones específicas de sitio o mutagénesis aleatoria. Thermofluor proporciona un método de alto rendimiento para evaluar los efectos de dichas variaciones de secuencia en la estabilidad de la proteína, así como medios para desarrollar condiciones estabilizadoras si fuera necesario. [ 46 ] [ 47 ]

Optimización de las condiciones de cristalización de proteínas

Aunque las proteínas son estructuras dinámicas en solución, se espera que la formación de cristales proteicos se vea favorecida cuando todas las moléculas se encuentran en su conformación de menor energía. Por consiguiente, la evaluación termofluorescente de las condiciones que estabilizan las proteínas es una estrategia útil para encontrar las condiciones óptimas de cristalización [ 9 ] [ 48 ] [ 8 ].

Detección de inhibidores de las interacciones proteína-proteína de moduladores de los cambios conformacionales de las proteínas

Dado que Thermofluor es un ensayo sin marcadores que detecta la unión de moléculas pequeñas a sitios de unión de alta afinidad en una proteína diana, es muy adecuado para encontrar inhibidores de moléculas pequeñas de interacciones proteína-proteína o sitios de modulación alostérica. [ 49 ] [ 50 ] Por supuesto, si una interacción proteína-proteína es finalmente "fármaco" susceptible de ser atacada con una molécula pequeña requiere la presencia de un sitio de unión adecuado en la proteína diana que proporcione suficientes interacciones energéticas locales para permitir la unión específica del fármaco.

Termofluor de proteínas de membrana

Las proteínas de membrana a menudo se aíslan en presencia de agentes solubilizantes hidrofóbicos que pueden separar colorantes de unión hidrofóbica como 1,8-ANS y SYPRO orange y generar un fondo de fluorescencia que dificulta la observación de la señal de fusión de la proteína Thermofluor. Sin embargo, una optimización cuidadosa de las condiciones (por ejemplo, para evitar la formación de micelas del agente solubilizante) a menudo puede producir condiciones de ensayo satisfactorias [ 18 ] [ 20 ].

Descifrando proteínas de función biológica desconocida

La función bioquímica de las proteínas diana identificadas mediante técnicas de inactivación génica o proteómica suele ser desconocida si presentan baja homología en la secuencia de aminoácidos con proteínas de función conocida. En muchos casos, se puede obtener información útil mediante la identificación de cofactores de unión o análogos de sustrato para clasificar la función proteica. La información obtenida con Thermofluor puede ayudar a descifrar la función de proteínas cuya función bioquímica, de otro modo, sería desconocida. [ 51 ] [ 52 ]

Ensayos de desplazamiento térmico paralelos

Los avances recientes han extendido los enfoques de desplazamiento térmico al análisis de interacciones de ligandos en mezclas complejas, incluidas células intactas. Las observaciones iniciales de proteínas individuales mediante proteólisis paralela rápida (FastPP) mostraron que la estabilización por unión de ligando podría conferir resistencia a la digestión proteolítica con termolisina. La protección relativa a la referencia se cuantificó mediante tinción de proteínas en geles o transferencia Western con un anticuerpo de marcaje dirigido a una etiqueta fusionada a la proteína diana. [ 29 ] CETSA, por ensayo de desplazamiento térmico celular, es un método que monitoriza el efecto de estabilización de la unión del fármaco mediante la prevención de la precipitación irreversible de proteínas, que generalmente se inicia cuando una proteína se desnaturaliza térmicamente. En CETSA, alícuotas de lisado celular se calientan transitoriamente a diferentes temperaturas, tras lo cual las muestras se centrifugan para separar las fracciones solubles de las proteínas precipitadas. La presencia de la proteína diana en cada fracción soluble se determina mediante transferencia Western y se utiliza para construir una curva de fusión CETSA que puede proporcionar información sobre la focalización in vivo, la distribución del fármaco y la biodisponibilidad. [ 30 ] Tanto FastPP como CETSA generalmente requieren anticuerpos para facilitar la detección del objetivo y, en consecuencia, se utilizan generalmente en contextos donde la identidad del objetivo se conoce a priori. Los desarrollos más recientes buscan fusionar aspectos de los enfoques FastPP y CETSA, al evaluar la protección proteolítica dependiente del ligando de los objetivos en las células utilizando espectrometría de masas (EM) para detectar cambios en los patrones de proteólisis asociados con la estabilización de proteínas. [ 53 ] Las implementaciones actuales todavía requieren conocimiento a priori de los objetivos esperados para facilitar el análisis de datos, pero las mejoras en las estrategias de recolección de datos de EM, junto con el uso de herramientas computacionales y estructuras de bases de datos mejoradas pueden permitir potencialmente que el enfoque se utilice para el descifrado de objetivos de novo a escala del proteoma celular total. Esto sería un avance importante para el descubrimiento de fármacos, ya que permitiría la identificación de objetivos moleculares discretos (así como interacciones fuera del objetivo) para fármacos identificados a través de cribados de fármacos celulares o fenotípicos de alto contenido.

Referencias

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