Secuenciación de ARN con resolución temporal

El método más sencillo para evaluar la abundancia de ARN a lo largo del tiempo consiste en utilizar múltiples muestras tratadas exactamente igual, con la única diferencia de la duración del tratamiento. Por ejemplo, para investigar un proceso biológico que se estima que dura una hora, un investigador podría diseñar un experimento en el que el proceso se active durante cinco minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, una hora y dos horas en muestras de cultivo celular separadas antes de recolectar las células para el análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq). De esta forma, el investigador obtendría mediciones del transcriptoma en cada uno de estos puntos temporales, y la comparación entre estas muestras indicaría qué procesos celulares se activan y desactivan con el tiempo.

Este método es el más común para la medición de ARN a lo largo del tiempo en modelos de cultivo celular, principalmente debido a su simplicidad. Cada muestra biológica solo necesita procesarse exactamente de la misma manera, y el factor tiempo se ajusta fácilmente en la mayoría de los protocolos experimentales. Además, dado que cada punto temporal constituye una muestra independiente, se puede recolectar y secuenciar una mayor cantidad de ARN para un estudio.

La necesidad de múltiples muestras para la recopilación de datos con resolución temporal aumenta el costo del experimento e introduce un mayor potencial de errores técnicos. Si bien el precio de la secuenciación masivamente paralela ha disminuido considerablemente desde su introducción, sigue siendo prohibitivamente caro para muchos laboratorios realizar estudios de RNA-seq a gran escala. Este problema se agrava al añadir puntos temporales, lo que incrementa el número de muestras en un múltiplo del número de puntos temporales; usar dos puntos temporales en lugar de uno duplica el número de muestras necesarias en un experimento. En consecuencia, muchos estudios que utilizan RNA-seq de series temporales se ven limitados, ya sea por el tamaño de la muestra, lo que reduce la potencia estadística , ^{[ 9 ]} o por el número de puntos temporales, lo que reduce su resolución temporal, o por ambos. Finalmente, al requerir un mayor número de muestras biológicas, existe un mayor riesgo de que el error humano afecte los resultados, lo que puede llevar a conclusiones erróneas ^{[ 10 ] [ 11 ].}

En este enfoque, las muestras de cultivo celular se cultivan con nucleótidos marcados que permiten la purificación selectiva de moléculas de ARN recién sintetizadas. Un enfoque popular es el marcaje pulsado con 4-tiouridina (4-sU), un análogo del uracilo que se incorpora a las moléculas de ARN recién sintetizadas. ^{[ 12 ]} En este tipo de experimento, un investigador suplementaría las células con 4-sU en el momento del experimento o poco antes. Cuando el tratamiento experimental presumiblemente afecta la expresión del ARN, el ARN recién sintetizado se marcaría con 4-sU. El ARN recién sintetizado se marca con un grupo tiol reactivo , lo que permite unir moléculas útiles al ARN. ^{[ 13 ]} La biotina es una molécula popular para usar en este tipo de ensayo, ya que es económica y se une increíblemente fuerte y selectivamente a la estreptavidina . La incubación de ARN biotinilado con perlas que contienen estreptavidina permite la purificación selectiva del ARN recién sintetizado. A partir de aquí, el ARN recién sintetizado y el ARN total se secuencian por separado y se comparan para detectar diferencias.

Affinity purification makes use of the incredibly popular biotin-streptavidin system for fractionation of biological materials. Binding of biotin to streptavidin is incredibly strong (K_d < 10⁻¹⁴ mol/L).^[14] It is also highly specific, which results in minimal background signal from non-specific binding events. Furthermore, time resolution is obtained in a single biological sample, resulting in reduced biological variability compared to using separate samples for each time point.

The weaknesses of this method are mainly centered around efficiency. One major difficulty is uptake of 4-sU into cultured cells. If 4-sU is given too early, then it will be incorporated into RNA that was not synthesized before the cell began responding to the experimental conditions. If it is given too late, then early stages of the cellular response are not captured by the experiment. The rate of uptake of 4-sU can be measured, but this requires additional experiments to determine optimal dosage and time. Furthermore, these parameters need to be measured in the specific cell lines of interest, as different cell lines may take up 4-sU more slowly than others. RNA is known to be prone to degradation in vitro. It is common for experimental protocols involving RNA to include a number of steps to reduce chances of Ribonuclease contamination or spontaneous degradation of samples, as RNA quality affects RNA-seq results.^[15] Metabolic labeling involves a number of additional steps that must be performed in the laboratory on RNA that is in solution. Since metabolic labeling requires that the RNA be kept unfrozen in liquid solution, some level of spontaneous degradation is unavoidable, although it is usually not to such an extent that results are affected. Of greater risk is the chances of ribonuclease contamination, which would render a sample useless, wasting time and resources. It is important for researchers working with RNA in any capacity to minimize unnecessary handling of RNA due to these risks. One additional drawback of using this method is, given equivalent sample size, more sequencing runs are required compared to a time-series experiment. This is because multiple RNA samples corresponding to the initial time point must be sequenced.

Research suggests that 4-sU labeling may result in transcriptional changes on its own, which would affect any results obtained using this method.^[16]

La conversión de nucleótidos funciona transformando algunos nucleótidos del ARN recién sintetizado en otros, que pueden detectarse mediante secuenciación. SLAMseq y Timelapse-seq son ejemplos de estos enfoques. ^{[ 17 ] [ 18 ]} Al igual que en la purificación por afinidad, las células se incuban con 4-sU. Tras la extracción del ARN de las muestras, se tratan con yodoacetamida (SLAMseq) o 2,2,2-trifluoroetilamina y periodato de sodio (Timelapse-seq), lo que convierte el 4-sU en un análogo de citosina que se secuencia como un nucleótido de citosina en lugar de uracilo. Durante el alineamiento de secuencias y el procesamiento de datos, las conversiones de U a C se utilizan para cuantificar el número de transcritos recién sintetizados en comparación con el ARN total. ^{[ 19 ]}

Este método comparte muchas ventajas con la purificación por afinidad; en particular, el hecho de que no se requieren múltiples muestras para una serie temporal. Este método elimina la necesidad de múltiples ejecuciones de secuenciación para múltiples puntos temporales, ya que todo el ARN se procesa conjuntamente en el instrumento de secuenciación y el ARN marcado se separa del no marcado in silico . Esto reduce significativamente los costos de secuenciación, ya que ahora se puede obtener resolución temporal sin necesidad de muestras adicionales ni ejecuciones de secuenciación adicionales. Además, al secuenciar múltiples puntos temporales simultáneamente, se reduce aún más la variabilidad técnica introducida por el procesamiento de muestras, además de la reducida variabilidad biológica que proporciona la estrategia experimental 4-sU.

Al igual que sus ventajas, este método comparte muchas desventajas con los métodos de purificación por afinidad. En particular, la captación de 4-sU y el mayor manejo de las muestras. Dado que Timelapse-seq se basa en métodos de química sintética para convertir nucleótidos, las reacciones incompletas conllevan una subestimación de la abundancia de ARN recién sintetizado y pueden generar variabilidad entre muestras.

A diferencia del marcaje metabólico, la secuenciación de transcripciones nacientes (NET-seq) secuencia directamente las transcripciones que aún están siendo transcritas por la ARN polimerasa II . ^{[ 20 ]} Este método permite estudiar la dinámica de la elongación de la transcripción , lo cual no es posible con las técnicas de marcaje metabólico. Para un experimento de NET-seq, las células se tratan como en un experimento estándar de RNA-seq hasta que se lisan . La lisis se realiza de manera que los complejos ARN-proteína permanezcan intactos, y la ARN polimerasa II se inmunoprecipita del lisado. El ARN que estaba siendo transcrito a partir del ADN todavía está unido a la ARN polimerasa y posteriormente se eluye de la polimerasa y se secuencia.

Dado que NET-seq extrae transcritos que no han completado su transcripción, es posible obtener resolución de un solo nucleótido en el nucleótido sintetizado más recientemente. Esto es valioso para el estudio de fenómenos como la cinética transcripcional . Además, permite el estudio de transcritos inestables que se degradan poco después de la transcripción. El enfoque general de inmunoprecipitación de proteínas de unión a ARN es de gran utilidad para comprender otras áreas de la biología del ARN, como el empalme .

Este método se basa en la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa II. La inmunoprecipitación presenta varios problemas, incluidas las interacciones de unión no específicas, que pueden provocar la inmunoprecipitación de moléculas de ARN no deseadas. La resolución temporal de NET-seq se limita a la elongación de la transcripción. Si bien es posible comparar las abundancias relativas entre transcritos mediante NET-seq, este no es el objetivo del método.