Transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo

La transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo ( TR-FRET ) es la combinación práctica de la fluorometría resuelta en el tiempo (TRF) con la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) que ofrece una herramienta poderosa para los investigadores del descubrimiento de fármacos. TR-FRET combina el aspecto de bajo fondo de TRF con el formato de ensayo homogéneo de FRET. El ensayo resultante proporciona un aumento en la flexibilidad, confiabilidad y sensibilidad además de un mayor rendimiento y menos resultados falsos positivos/falsos negativos. FRET involucra dos fluoróforos , un donante y un aceptor. ^{[ 1 ]} La excitación del donante por una fuente de energía (por ejemplo, lámpara de destellos o láser) produce una transferencia de energía al aceptor si ambos están dentro de una determinada proximidad entre sí. El aceptor a su vez emite luz en su longitud de onda característica.

El aspecto FRET de la tecnología está impulsado por varios factores, incluyendo la superposición espectral y la proximidad de los fluoróforos involucrados, donde la transferencia de energía ocurre solo cuando la distancia entre el donante y el aceptor es suficientemente pequeña. En la práctica, los sistemas FRET se caracterizan por el radio de Förster (R₀ ₎ : la distancia entre los fluoróforos a la cual la eficiencia FRET es del 50%. Para muchos pares de fluoróforos FRET, R₀ _se encuentra entre 20 y 90 Å, dependiendo del aceptor utilizado y la disposición espacial de los fluoróforos dentro del ensayo. ^{[ 1 ]} Mediante la medición de esta transferencia de energía, se pueden evaluar las interacciones entre biomoléculas acoplando cada socio con una etiqueta fluorescente y detectando el nivel de transferencia de energía. La emisión del aceptor como medida de la transferencia de energía se puede detectar sin necesidad de separar los componentes del ensayo unidos de los no unidos (por ejemplo, un paso de filtración o lavado), lo que resulta en una reducción del tiempo y el costo del ensayo. ^{[ 2 ]}

Los ensayos TR-FRET homogéneos de mezcla y lectura ofrecen ventajas sobre otros ensayos de cribado biomolecular, como los ensayos de polarización de fluorescencia (FP) o TRF. ^{[ 3 ]} En los ensayos FP, la fluorescencia de fondo debida a los compuestos de la biblioteca normalmente está despolarizada y la señal de fondo debida a la luz dispersa (p. ej., compuestos precipitados) normalmente está polarizada. Dependiendo de la configuración del ensayo, cualquiera de los dos casos puede conducir a un resultado falso positivo o falso negativo. Sin embargo, debido a que la especie donadora utilizada en un ensayo TR-FRET tiene una vida media de fluorescencia que es muchos órdenes de magnitud mayor que la fluorescencia de fondo o la luz dispersa, la señal de emisión resultante de la transferencia de energía se puede medir después de que cualquier señal interferente se haya desintegrado por completo. Los ensayos TR-FRET también se pueden formatear para utilizar concentraciones limitantes de receptor y concentraciones excesivas de trazador (a diferencia de los ensayos FP), lo que puede proporcionar ahorros de costes adicionales. ^{[ 4 ]} En el caso de los ensayos TRF, se requiere un paso de lavado para eliminar los reactivos fluorescentes no unidos antes de medir la señal de actividad del ensayo. Esto aumenta el uso de reactivos , el tiempo para completar el ensayo y limita la capacidad de miniaturizar el sistema (por ejemplo, convertir una placa de microtitulación de 384 pocillos a una placa de 1536 pocillos ). ^{[ 5 ]} Los ensayos TR-FRET aprovechan la proximidad requerida de las especies donadora y aceptora para la generación de señal.

Además, algunos investigadores prefieren este método porque no depende de materiales radiactivos para generar la señal que se va a detectar. Esto evita tanto los riesgos del uso de dichos materiales como el costo y la logística de su almacenamiento, uso y eliminación. ^{[ 6 ]}

Aunque la técnica TR-FRET puede realizarse con diversas combinaciones de fluoróforos, los metales lantánidos resultan especialmente útiles. Ciertas aplicaciones en ciencias biológicas aprovechan las propiedades de fluorescencia únicas de los complejos de iones lantánidos (quelatos o criptatos de Ln(III)). Estos son idóneos para esta aplicación debido a sus grandes desplazamientos de Stokes y tiempos de vida de emisión extremadamente largos (de microsegundos a milisegundos) en comparación con fluoróforos más tradicionales (por ejemplo, fluoresceína , aloficoyanina, ficoeritrina y rodamina ). Los fluidos biológicos o el suero comúnmente utilizados en estas aplicaciones de investigación contienen numerosos compuestos y proteínas fluorescentes naturales. Por lo tanto, el uso de la medición de fluorescencia convencional en estado estacionario presenta serias limitaciones en la sensibilidad del ensayo. Los fluoróforos de larga duración, como los lantánidos, combinados con la detección resuelta en el tiempo (un retardo entre la excitación y la detección de la emisión), minimizan la interferencia de la fluorescencia inmediata. Este método (conocido comúnmente como fluorometría resuelta en el tiempo o TRF) utiliza dos fluoróforos: un donante y un aceptor. La excitación del fluoróforo donante (en este caso, el complejo del ion lantánido) mediante una fuente de energía (por ejemplo, una lámpara de destellos o un láser) produce una transferencia de energía al fluoróforo aceptor si se encuentran a una distancia determinada (conocida como radio de Förster). El fluoróforo aceptor, a su vez, emite luz a su longitud de onda característica. A continuación se muestran los dos lantánidos más utilizados en ensayos de ciencias biológicas, junto con su colorante aceptor correspondiente, así como sus longitudes de onda de excitación y emisión y el desplazamiento de Stokes resultante (separación entre las longitudes de onda de excitación y emisión).

Ejemplo de TR-FRET

Como se indica en la tabla anterior, la transferencia de energía fluorescente del europio a la aloficocianina puede utilizarse de forma temporalmente resuelta, especialmente en ensayos de cribado biomolecular. La figura de la derecha muestra la intersección de la emisión del europio con la excitación de la aloficocianina (APC), donde se produce la transferencia de energía cuando el europio y la APC se aproximan mediante interacciones biomoleculares.

Cuando estos dos fluoróforos se unen mediante una interacción biomolecular, una parte de la energía capturada por el europio durante la excitación se libera mediante emisión de fluorescencia a 620  nm, mientras que la energía restante se transfiere al APC. Esta energía es liberada posteriormente por el APC como fluorescencia específica a 665  nm únicamente a través de FRET con el europio.

Mediante el diseño del ensayo de cribado de alto rendimiento , los materiales se mezclan y, si la enzima actúa sobre el péptido, todos los componentes se unirán a sus respectivos objetivos y se producirá FRET. ^{[ 8 ]}

El instrumento utilizado para medir el ensayo retrasa la lectura de la luz emitida varios cientos de milisegundos después de la luz incidente/de excitación (el pulso de energía lumínica suministrado por el instrumento para excitar la molécula donante) con el fin de eliminar cualquier interferencia entre las señales de excitación y emisión. (En este caso, la interferencia se refiere a la superposición de perfiles espectrales, lo que podría dar lugar a falsos positivos, falsos negativos o una sensibilidad reducida, según el diseño del ensayo. ^{[ 9 ]} ) Este proceso constituye el aspecto de resolución temporal del ensayo.